陳穎博 潘 杰 林靜吟 馮小映

萬應理傷膏由我院“廣東省名中醫(yī)”黃敏院長的多年臨床經(jīng)驗方研制而成，主要由川烏、草烏、半夏等成分組成，具有活血祛瘀、舒筋活絡(luò)、消腫止痛的功效，對各種跌打扭傷、閉合性骨折[1]及各種外傷引起的疼痛[2]有確切的療效，治療有效率達91.80%[3]。臨床應用逾二十年，廣泛用于中醫(yī)骨傷的各種治療，如骨折手法復位等，在華南地區(qū)享有盛譽[4]。

萬應理傷膏為我院內(nèi)部的協(xié)定外用藥，根據(jù)我國藥品管理的規(guī)定[5-6]，僅限于醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)使用。盡管多年來的臨床觀察[1-3]提示萬應理傷膏治療效果良好且不良反應少，但因缺乏系統(tǒng)的藥學臨床科學研究，極大地限制了其推廣與使用。近年來，隨著我院業(yè)務(wù)量發(fā)展及知名度提升，萬應理傷膏的年產(chǎn)量和使用量不斷攀升。為確保藥物的穩(wěn)定性和安全性，我院已逐步開展萬應理傷膏的質(zhì)量控制體系研究，保證各批次的質(zhì)量和安全性達標。然而在藥效學評價方面，卻未曾進行動物模型方面的探索。本研究是國內(nèi)首次利用小鼠建模對萬應理傷膏進行藥效學方面考察，為評價其鎮(zhèn)痛及抗炎作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

昆明系小鼠，SPF級，體質(zhì)量(20±2)g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥物

萬應理傷膏(廣州市正骨醫(yī)院，生產(chǎn)批號 20200501)；基質(zhì)(卡波姆)；扶他林乳膠膏(北京諾華制藥有限公司，生產(chǎn)批號 VP2526202302)；瑪貝拉脫毛膏(廣州詩妃化妝品有限公司，生產(chǎn)批號 20200521)。

1.3 主要實驗儀器

8 mm 打孔器，萬分位電子分析天平(SHIMADZU，型號 AUW120D)。

1.4 實驗方法[7]

1.4.1 對小鼠扭體法鎮(zhèn)痛實驗的影響

昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只。每天涂藥1次(給藥前1天用脫毛膏脫毛)，基質(zhì)對照組涂等量的基質(zhì)，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，每只小鼠腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.2 mL致痛。觀察并記錄小鼠出現(xiàn)扭體反應的潛伏期及15 min 內(nèi)扭體反應的次數(shù)，并計算抑制率和鎮(zhèn)痛率。抑制率=[(給藥組潛伏期均值-模型組潛伏期均值)/模型組潛伏期均值]×100%。鎮(zhèn)痛率=[(模型組扭體次數(shù)均值-給藥組扭體次數(shù)均值)/模型組扭體次數(shù)均值]×100%。

1.4.2 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只。每只小鼠右耳廓正反兩面涂以基質(zhì)或藥物，每天1次，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，精密吸取二甲苯均勻涂于各鼠右耳正反兩面，劑量為每只0.05 mL，左耳不涂作為對照。二甲苯涂耳1 h后，處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，采用8 mm 直徑打孔器分別于左右耳對稱部位打下耳片，用精密電子分析天平稱量各鼠耳片質(zhì)量，并計算腫脹度和抑制率。腫脹度=左耳片重-右耳片重，抑制率=[(模型組腫脹度均值-給藥組腫脹度均值)/模型組腫脹度均值]×100%。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 實驗結(jié)果

2.1 扭體法鎮(zhèn)痛實驗的影響

2.1.1 對潛伏期的影響

萬應理傷膏各劑量組均能明顯延長冰醋酸所致小鼠首次扭體反應的發(fā)生時間，與基質(zhì)對照組相比存在非常顯著的差異(P<0.01)。其中，高劑量組的潛伏期最長，但萬應理傷膏各劑量組的組間差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，高劑量組對小鼠首次扭體反應出現(xiàn)的抑制率為53.28%，高于陽性對照扶他林乳膏組8.02%。萬應理傷膏各劑量組潛伏期與扶他林乳膏組相比，組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見圖1、表1。

表1 萬應理傷膏對冰醋酸所致小鼠扭體反應潛伏期的影響

圖1 萬應理傷膏對冰醋酸所致小鼠扭體反應潛伏期的影響

2.1.2 15 min內(nèi)扭體的次數(shù)

萬應理傷膏各劑量組均能有效降低小鼠扭體反應次數(shù)，與基質(zhì)對照組相比存在非常顯著的差異(P<0.01)。其中，高劑量組與低劑量組相比，結(jié)果存在顯著差異(P<0.05)，有統(tǒng)計學意義。就萬應理傷膏而言，低、中劑量組對冰醋酸所致的小鼠扭體反應次數(shù)有抑制趨勢，而高劑量組則能明顯減少扭體反應的次數(shù)。此外，高劑量組鎮(zhèn)痛率較陽性對照扶他林乳膏組高7.79%。但各劑量組扭體次數(shù)與扶他林乳膏組相比，組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見圖2、表2。

表2 萬應理傷膏對冰醋酸所致小鼠15 min內(nèi)扭體次數(shù)的影響

圖2 萬應理傷膏對冰醋酸所致小鼠15 min內(nèi)扭體次數(shù)的影響

2.2 二甲苯致耳腫脹的影響

小鼠二甲苯致炎后，耳廓出現(xiàn)腫脹，萬應理傷膏各劑量組均呈現(xiàn)對炎癥的良好抑制作用，與基質(zhì)對照組相比存在非常顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。其中，抗炎作用最明顯的是高劑量組，腫脹抑制率為47.06%，但各劑量組的組間差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，高劑量組抑制率與陽性對照扶他林乳膏組相比，略高1.18%，但組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見圖3、表3。

表3 萬應理傷膏對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

圖3 萬應理傷膏對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

3 討論

急性軟組織損傷早期引起的紅、腫、熱、痛等臨床癥狀，是由急性外傷或直接暴力作用于機體而引起的無菌性炎癥。臨床上主要采用非甾體抗炎藥、人工合成鎮(zhèn)痛藥、糖皮質(zhì)激素等藥物治療。但這些藥物副作用較大，長期使用會對人體多個系統(tǒng)造成影響。萬應理傷膏為我院中藥制劑，多年來用于治療急性軟組織損傷臨床療效佳，不良反應少，深受醫(yī)生和患者認可。本研究選用扶他林乳膏作陽性對照藥物，因其在國內(nèi)外上市多年，臨床數(shù)據(jù)充分[8-12]，療效明確。而萬應理傷膏的售價僅為扶他林乳膏的二分之一，是臨床用藥的有益補充。

扭體法以冰醋酸作為化學刺激評價藥物的鎮(zhèn)痛效果至今已沿用多年[13-17]，常用作評估藥物的外周鎮(zhèn)痛活性[18-19]。因其具備操作簡便，不需特殊設(shè)備、復制成功率高等優(yōu)點，被廣泛應用于國內(nèi)外研究實驗[19-25]，方法成熟可靠[16, 26]。本研究采用扭體法觀察萬應理傷膏對小鼠的鎮(zhèn)痛作用，以小鼠出現(xiàn)扭體反應潛伏期和15 min內(nèi)扭體反應的次數(shù)作為評價鎮(zhèn)痛效果的指標。從實驗結(jié)果看，觀察扭體次數(shù)比潛伏期更為敏感，能體現(xiàn)萬應理傷膏不同劑量的組間鎮(zhèn)痛效果差異。低劑量組呈現(xiàn)一定的鎮(zhèn)痛作用，隨著萬應理傷膏劑量增加，鎮(zhèn)痛效果逐步增強，呈劑量依賴性，作用最強的是高劑量組。此外，兩指標間存在相關(guān)性。潛伏期(即首次出現(xiàn)扭體反應的時間)越長，小鼠在15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體的次數(shù)越少，兩者結(jié)合評價更能體現(xiàn)萬應理傷膏的鎮(zhèn)痛作用。

本研究設(shè)定的實驗組劑量和療程均在安全范圍內(nèi)，結(jié)果顯示高劑量組的鎮(zhèn)痛效果最優(yōu)，提示萬應理傷膏的臨床治療劑量可設(shè)定為一日5次，以提高嚴重腫痛患者的療效。周敏杰在質(zhì)量標準研究中提到，萬應理傷膏以生川烏和生草烏作為君藥，加入天然冰片、薄荷腦等引藥[27]，產(chǎn)生協(xié)同鎮(zhèn)痛的作用。筆者認為，鑒于生川烏、生草烏的毒性較大，除了需在制劑生產(chǎn)過程中對其含量嚴格控制外，臨床治療劑量和療程的制定也同樣重要。使用劑量過大或療程太長，可能會累積產(chǎn)生毒副作用。今后應深入開展萬應理傷膏的毒理學研究，以更好地指導合理用藥，避免不良反應，提高臨床藥物治療水平。

在小鼠急性炎癥模型實驗中，采用二甲苯致小鼠耳腫脹來初步考察萬應理傷膏的抗炎作用。谷捷等[28]提出在中藥創(chuàng)新藥研究中，應用二甲苯致炎模型與臨床常見急性炎癥相似，廣泛用于中藥抗炎創(chuàng)新藥物的抗炎效應評價，也常被藥理學等課程實驗教學所選用。本研究結(jié)果顯示萬應理傷膏抗炎作用明顯，中、高劑量的作用強度相似或高于扶他林乳膏。由此表明，在急性創(chuàng)傷所致的皮膚組織炎癥中，使用中、高劑量治療(一日3～5次)將獲得良好的抗炎效果。

盡管本研究取得了一些有價值的結(jié)果，但仍存在局限性。本次研究中，尚未開展小鼠熱板刺激實驗[29]，未測定萬應理傷膏對熱刺激產(chǎn)生組織損傷所致疼痛的抑制作用。熱板刺激實驗常用于評估藥物的中樞鎮(zhèn)痛作用[18]，與評估外周鎮(zhèn)痛作用的扭體法結(jié)合，可以很好地評價萬應理傷膏治療疼痛的效果。它的缺乏，將影響萬應理傷膏的整體疼痛評價。此外，O V Sintsova等[30]在最新的研究中指出，TPRV1受體阻斷劑在熱板刺激實驗中展現(xiàn)較長的鎮(zhèn)痛作用。TPRV1是近年研究的熱點，被認為治療疼痛和皮膚炎癥[31]的有效靶點。熱板刺激實驗的推進，有利于明確萬應理傷膏發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的部位和機制。因此，我院將繼續(xù)開展鎮(zhèn)痛效應的研究，逐步充實萬應理傷膏的藥學臨床科學研究基礎(chǔ)。

綜上所述，在小鼠建模中萬應理傷膏初步展現(xiàn)良好的抗急性炎癥作用和鎮(zhèn)痛作用，藥效學研究結(jié)果與臨床療效相符。今后仍需進一步探討物理刺激(熱刺激)引起疼痛的抑制效果，并推進藥物安全性研究，建立藥效學、毒理學、臨床藥理學等方面的評價。同時，開展臨床研究，觀察藥物不良反應，以明確各種適應癥的治療劑量范圍。