閆世梁　張生克　劉銀霞　史小利　肖媛　勾麗莉

摘 要：以枯草芽孢桿菌XB02為出發(fā)菌株，采用紫外誘變原生質體的方法，獲得了1株D-核糖高產菌株T32，其搖瓶發(fā)酵產糖達103.6g/L。遺傳性狀穩(wěn)定良好。

關鍵詞：D-核糖；草芽孢桿菌；原生質體；紫外誘變

D-核糖是一種五碳糖，是RNA等的組成糖，在醫(yī)藥中間體、醫(yī)療保健、運動營養(yǎng)等領域具有廣泛的用途。發(fā)酵法是目前最先進的D-核糖生產方法，D-核糖高產菌株的選育一直是國內外從業(yè)者關注的問題 [1]。

去除了細胞壁的原生質體經誘變更易發(fā)生突變[2]，本實驗旨在對D-核糖產生菌進行原生質體誘變，以期獲得高產菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）轉酮醇酶變異株XB02。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 完全培養(yǎng)基

牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%， 葡萄糖0.1%，NaCl 0.5%， 瓊脂2.0%，pH6.7-7.0。

1.2.2 再生培養(yǎng)基

完全培養(yǎng)基加入0.5mol/L的蔗糖和0.02mol/L的MgCl2，pH6.7-7.0。

1.2.3 篩選培養(yǎng)基[3]

完全培養(yǎng)基中加入6.0%的D-核糖，pH6.7-7.0。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖20%、玉米漿3%、（NH4）2SO4 0.6%、CaCO3 3.6%、MnSO4·4H2O 0.005%。pH 6.7-7.0。

1.3 溶液

1.3.1 高滲緩沖液

丁二酸鈉42.57g/L，蔗糖170.0g/L，MgCl2 4.06g/L，pH 6.7，115℃滅菌20min

1.3.2 蛋清溶菌酶溶液

高滲溶液配制濃度為1mg/ mL的蛋清溶菌酶液，微孔過濾除菌。

1.4 方法

1.4.1 出發(fā)菌株的培養(yǎng)

出發(fā)菌株接種于20mL /250mL完全培養(yǎng)基培養(yǎng)基的三角瓶，220r/min，36℃培養(yǎng)。定時測定OD590nm，用對數中后期的菌體進行原生質體制備及誘變。

1.4.2 原生質體制備

取5mL培養(yǎng)液，4500r/min，離心15min，棄上清。用高滲溶液洗滌菌體2次，加入溶菌酶菌懸液5mL，36℃酶解120min。4500r/min離心15min，棄上清。用高滲溶液洗滌菌體2次，配成高滲菌懸液5mL。

1.4.3 原生質體再生

以高滲緩沖液梯度稀釋，取0.1mL稀釋菌液涂布于再生平板，36℃培養(yǎng)2-3d。

1.4.4 原生質體誘變及篩選

調整原生質體高滲懸液的濃度為108cfu/mL，取10mL于培養(yǎng)皿中，置于磁力攪拌器上，20W紫外燈垂直距離20cm照射。取不同照射時間的處理液，涂布于再生平板上，計算原生質體的死亡率。

再生培養(yǎng)基平板上長出的菌落對應地挑于完全培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基上，選取在篩選培養(yǎng)基上生長良好的菌落作為初篩菌株。然后進行搖瓶發(fā)酵，D-核糖產率較高的即為目的菌株。

1.4.5 遺傳穩(wěn)定性實驗

將篩選到的高產菌株連續(xù)傳種10代，將2、4、6、8、10代菌株接入20mL/250mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，220r/min，36℃搖瓶發(fā)酵至殘?zhí)菫榱?，分別測定培養(yǎng)基中D-核糖含量。

1.5 測定方法

①D-核糖含量的測定：

苔黑酚法。

②發(fā)酵轉化率的計算：

發(fā)酵轉化率（%） = 發(fā)酵液D-核糖量/培養(yǎng)基中葡萄糖量×198/150×100%

2 結果與討論

2.1 菌齡選擇

經測定，10-12h為XB02生長的對數中后期，選擇此時進行原生質體的制備及誘變。

2.2 原生質體紫外誘變

死亡率與誘變時間的關系如圖1。一般認為死率為70%～80%時誘變效果最好。因此，選擇誘變時間為20s，此時的致死率74.9%。

2.3 D-核糖高產菌株的篩選

紫外誘變后從再生培養(yǎng)基上挑菌106株，均可完全培養(yǎng)基上生長，可在篩選培養(yǎng)基上生長的有9株。然后進行搖瓶發(fā)酵，選出了3株D-核糖高產菌株，其發(fā)酵結果如表1。3株菌的產糖性能均比較穩(wěn)定，其中T32產糖平均可達103.6g/ L。

2.4 菌株T32的遺傳穩(wěn)定性

菌株T32的遺傳穩(wěn)定性考察結果見圖2，經多次傳代，菌株T32的產糖能力無明顯變化，遺傳性狀穩(wěn)定，有望應用于工業(yè)生產。

3 結論

對出發(fā)菌株XB02進行原生質體制備，并對原生質體進行了紫外誘變，得到了一株D-核糖高產菌株T32，其遺傳性狀穩(wěn)定，有望應用于工業(yè)生產中。

圖2 菌株T32的遺傳穩(wěn)定性

參考文獻：

[1]夏海平，吳義明.D-核糖生產菌的選育及發(fā)酵工藝的改進[J].氨基酸和生物資源，2006（04）：30-32.

[2]常景玲，張志宏，劉學良.D-核糖生產菌的原生質體誘變及其發(fā)酵培養(yǎng)[J].生物技術通訊，2006（02）：195-197.