袁保輝,劉桂芹,劉 敏,李大成,韓 軍,王正平

(聊城大學(xué)臨床營養(yǎng)研究中心,山東聊城 252000)

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復(fù)方D-核糖對小鼠抗疲勞作用的研究

袁保輝,劉桂芹,劉 敏,李大成,韓 軍,王正平

(聊城大學(xué)臨床營養(yǎng)研究中心,山東聊城 252000)

本實驗以80只雄性小鼠為實驗動物,通過連續(xù)四周的灌胃實驗研究了核糖復(fù)方對疲勞小鼠生理功能的影響。實驗小鼠被隨機分為生理鹽水組、核糖組、人參瑪咖組以及核糖復(fù)方組。在各組給予相應(yīng)的干預(yù)措施下,測定了小鼠末次運動0 h和24 h后的血清乳酸含量、尿素氮含量及肝糖原含量的變化。結(jié)果表明,與對照組比較,D-核糖及核糖復(fù)方在急性疲勞期間可以顯著延長小鼠的游泳時間(p<0.05);長期疲勞中,核糖復(fù)方組可以增加小鼠的肝糖原(p<0.01),降低血清乳酸(p<0.01)及尿素氮(p<0.05)含量。實驗結(jié)果證實核糖復(fù)方總體效果優(yōu)于人參瑪咖及核糖單方的抗疲勞功效；對急性疲勞中的小鼠,D-核糖及其核糖復(fù)方均具有明顯的抗疲勞作用;對長期疲勞的小鼠,D-核糖沒有表現(xiàn)出明顯的抗疲勞作用。

小鼠,抗疲勞,D-核糖,人參,瑪咖,D-核糖復(fù)方

D-核糖天然存在于所有生命細(xì)胞中,是生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)核酸的重要組成成份,與腺苷酸的形成和ATP的再生有關(guān)[1]。D-核糖除了在核苷類物質(zhì)、蛋白質(zhì)及脂肪代謝中處于樞紐位置[2],具有重要的生物功能外,更在心臟和骨骼肌代謝中起關(guān)鍵作用。D-核糖的生理作用已成為近年來營養(yǎng)保健領(lǐng)域的研究熱點,其臨床應(yīng)用也逐漸增多[3]。歐美市場上有關(guān)D-核糖的食品及保健食品比較豐富[4],國內(nèi)以D-核糖作為功效因子添加的保健食品較少。研究表明,D-核糖能夠促進局部缺血組織、局部缺氧組織的功能恢復(fù)[5]、還有助于由心肌缺血缺氧引起的心臟功能下降的恢復(fù)[6]。還有數(shù)據(jù)表明,D-核糖能有效解除機體疲勞、消除肌肉酸痛強直[7]及痙攣[8],外源D-核糖通過直接進入ATP的重新合成過程[1]顯現(xiàn)出明顯的抗疲勞功能。但前期的動物實驗數(shù)據(jù)卻反映出D-核糖在提高動物的耐力上具有一定的局限性。國內(nèi)外諸多文獻(xiàn)表明,人參[9]、瑪咖[10]具有良好的抗疲勞功效,其作用原理有別于D-核糖的機制。為此,本課題擬以核糖、人參和瑪咖組成復(fù)合配方,探究復(fù)方D-核糖對小鼠游泳能力及長期疲勞后生理功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級昆明種小鼠 100只,動物批號:N0.37009200000724,濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,4周齡,體質(zhì)量(19±1) g,單一雄性;標(biāo)準(zhǔn)鼠顆粒飼料 濟南朋悅實驗動物繁育有限公司;D-核糖 純度99.2%,由江西誠志生物工程有限公司提供;人參提取物(UV含量10%)、瑪咖提取物 由浙江天草生物制品有限公司提供;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

塑料游泳箱(80 cm×50 cm×50 cm);S-3100紫外分光光度計 Scinco;5804R臺式冷凍離心機 Eppendorf;BIO-MEDICAL超低溫保存冰箱 Haier;雙列大孔儀表恒溫水浴鍋 上海樹立儀器儀表有限公司;FB224電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;乳酸測定試劑盒、肝糖原試劑盒、血清尿素氮試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 各組灌胃液均以高溫滅菌的雙蒸水為溶劑,4 ℃儲存。100 mL核糖復(fù)方中含有10 g D-核糖、1 g人參提取物、1 g瑪咖提取物;100 mL人參瑪咖溶液含有1 g人參提取物、1 g瑪咖提取物;100 mL核糖溶液含有10 g D-核糖。D-核糖的劑量選擇參考Hellsten[11]的報道,核糖復(fù)方劑量的選擇參考預(yù)實驗優(yōu)選結(jié)果。

1.2.2 動物分組與模型 100只小鼠購進后,實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,進行連續(xù)3 d的適應(yīng)性游泳訓(xùn)練,每天游泳20 min。隨后進行游泳能力篩選實驗,淘汰體重及游泳能力與平均水平有顯著性差異的小鼠,淘汰后剩余80只。按體重隨機分為4組,每組20只,分別為生理鹽水組(NC組)、D-核糖組(DH組)、人參瑪咖組(RM組)、核糖復(fù)方組(HF組)。每日灌胃1次,連續(xù)28 d,每兩天稱體重1次,根據(jù)小鼠的體重按0.10 mL/10 g劑量經(jīng)口灌胃,每天給藥30 min后進行負(fù)重游泳實驗。每天負(fù)重游泳實驗的水箱溫度為25 ℃,鉛皮綁定在小鼠尾根部。

急性疲勞模型:第1周綁定小鼠體質(zhì)量3.5%的鉛皮游泳,每天游泳至力竭,記錄力竭時間,通過比較同一組小鼠每天的游泳能力是否呈現(xiàn)穩(wěn)定的顯著性差異,來決定小鼠的急性疲勞模型是否成功。長期疲勞模型:第2周負(fù)重增加為體質(zhì)量的4%,每天游泳至力竭,撈出并記錄時間;第3周負(fù)重增加為體質(zhì)量的4.5%,每天游泳至力竭;第4周的每天上午增加不負(fù)重游泳10 min(水溫20 ℃),間隔6 h后再進行負(fù)重體質(zhì)量5%的游泳,共4周。

1.2.3 樣品處理以及指標(biāo)測定 末次給藥30 min后,進行負(fù)重游泳實驗,待小鼠力竭后撈出,各組一半小鼠立即取血,剩余一半小鼠在運動24 h后取血。取血方式是用毛細(xì)管從眼眶內(nèi)眥采血0.7 mL(不加抗凝劑),然后將血液置4 ℃冰箱約2 h,3700 r/min離心10 min后取血清,血清分裝兩管,置于-20 ℃冰箱凍存。前面一半小鼠取血后立即頸椎脫臼處死,剩余的小鼠運動結(jié)束72 h后以同樣方法處死,取出肝臟、心臟、腓腸肌,將樣品迅速投到液氮中速凍,然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。取肝臟約0.1 g在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱重,根據(jù)試劑盒說明書要求測定肝糖原含量(蒽酮法)。血清解凍后,根據(jù)試劑盒說明書要求測定血清的尿素氮含量(二乙酰肟比色法)和血清乳酸含量(比色法)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19統(tǒng)計軟件進行分析,各組的結(jié)果分別以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間的數(shù)據(jù)差異比較用單因素方差分析法,當(dāng)數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義時再用最小顯著差值法(LSD)進行兩兩比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠第1周的游泳時間比較

由圖1～圖4可知,各組小鼠在前期先進入游泳適應(yīng)期,游泳能力達(dá)到頂峰后逐漸下降或趨于平穩(wěn)。生理鹽水組第4 d游泳能力最強,平均游泳時間由415 s提高到536 s;D-核糖組第3 d游泳能力最強,平均游泳時間由416 s提高到712 s;人參瑪咖組第2 d游泳能力最強,平均游泳時間由426 s提高到556 s;核糖復(fù)方組第2 d游泳能力最強,平均游泳時間由452 s提高到664 s。各組出現(xiàn)最強游泳能力后,隨后幾天與這一天比較出現(xiàn)不同程度的顯著性差異,說明各組均進入不同程度的運動性疲勞期,表明急性疲勞模型構(gòu)建成功。

圖1 NC組小鼠第1周力竭時間Fig.1 Swimming time of the NC group of first week注：各實驗組每天的力竭時間與該組力竭時間最高值比較，*表示有顯著性差異(p<0.05)，**表示有極顯著性差異(p<0.01)；圖2～圖4同。

圖2 DH組小鼠第1周力竭時間Fig.2 Swimming time of the DH group of first week

表1 各組小鼠負(fù)重游泳力竭時間比較±s,n=20)

圖3 RM組小鼠第1周力竭時間Fig.3 Swimming time of the RM group of first week

圖4 HF組小鼠第1周力竭時間Fig.4 Swimming time of the HF group of first week

注:*表示與生理鹽水組組比較差異顯著,p<0.05;**表示與生理鹽水組組比較差異極顯著,p<0.01。2.2 各處理組小鼠負(fù)重游泳力竭時間

由表1數(shù)據(jù)可知,與生理鹽水組比較,核糖組在第3 d呈極顯著性差異,人參瑪咖組在第9、11、23、27 d呈顯著性差異,核糖復(fù)方組在第2、5、8、9、11、27 d呈顯著性差異。數(shù)據(jù)表明,D-核糖在運動前期具有一定抗疲勞功效,但在后期功效不顯著;人參瑪咖組合物的抗疲勞功效主要體現(xiàn)在疲勞模型后期;核糖復(fù)方組合物在全程均具有一定的抗疲勞功效。人參瑪咖復(fù)方的抗疲勞功效比較慢速,所以在前期的作用不明顯,在后期逐漸呈現(xiàn)出一定的抗疲勞功效。

外源供給的D-核糖在機體內(nèi)代謝迅速[12],可以繞過磷酸戊糖途徑中的限速步驟,使心肌和骨骼肌細(xì)胞通過重新合成過程快速合成5-磷酸核糖-1-焦磷[13](PRPP)。隨著PRPP含量增加,肌肉組織的腺苷酸合成速度加快,從而使組織中的ATP含量得以快速恢復(fù)[14]。這樣,組織中增加的ATP將支持肌肉組織進行更長時間的收縮,小鼠的游泳能力也會相應(yīng)延長,這一作用使D-核糖在疲勞模型前期具有一定功效。隨著疲勞程度的增加,核糖組的優(yōu)勢逐漸不明顯,可能是由于D-核糖對機體ATP的補充作用彌補不了它的流失,說明核糖在長期疲勞中的作用不顯著,實驗結(jié)果與Hellsten[11]等的研究結(jié)果相符。

2.3 對小鼠肝糖元的影響

由表2數(shù)據(jù)可知,運動后即刻,與生理鹽水對照組比較,D-核糖組無明顯變化;人參瑪咖組有顯著性提高(p<0.05);核糖復(fù)方組有極顯著提高(p<0.01)。D-核糖組的肝糖原含量極顯著低于核糖復(fù)方組(p<0.01),人參瑪咖組低于核糖復(fù)方組但無統(tǒng)計學(xué)意義。

機體處于疲勞狀態(tài)時,糖分解代謝占優(yōu)勢,為了維持穩(wěn)定的血糖濃度,機體的糖異生作用將加強[15],同時機體會促進糖原降解,抑制肝糖原合成[16],所以肝糖原的含量是機體抗疲勞的指標(biāo)之一。本實驗中核糖復(fù)方及人參瑪咖組可以明顯的提高運動中小鼠的肝糖原含量,D-核糖組并未出現(xiàn)顯著性增加,說明核糖復(fù)方中人參瑪咖組合物可以增加肝糖原的儲備。在長期運動疲勞中,人參瑪咖與核糖復(fù)方可以具有良好的作用,可能是核糖復(fù)方中的人參瑪咖通過提高小鼠的肝糖原儲備,來提高小鼠的抗疲勞作用。

表2 各組小鼠肝糖原的比較

注:*表示與NC組比較差異顯著,p<0.05;**表示與NC組比較差異極顯著,p<0.01;#表示與核糖復(fù)方組比較差異顯著,p<0.05;##表示與核糖復(fù)方組比較差異極顯著,p<0.01;表3、表4同。

2.4 對小鼠血乳酸的影響

由表3數(shù)據(jù)可知,運動后即刻,與生理鹽水對照組比較,核糖復(fù)方組乳酸含量極顯著降低(p<0.01);核糖組與人參瑪咖組降低不顯著。與核糖復(fù)方組比較,人參瑪咖組顯著高于核糖復(fù)方組;核糖組無顯著性差異。運動后24 h,與生理鹽水對照組比較,D-核糖組與核糖復(fù)方組均有顯著降低(p<0.05)。與核糖復(fù)方組比較,核糖組與人參瑪咖組沒有顯著性差異。數(shù)據(jù)表明,核糖可以加速乳酸循環(huán)及乳酸的清除速度,可能是由于核糖可以加速乳酸循環(huán)速度,人參瑪咖在清除乳酸的作用上不明顯。

機體經(jīng)歷血供不足、高強度運動或重體力勞動時,心肌和骨骼肌處于相對缺氧狀態(tài),細(xì)胞的有氧氧化過程受到嚴(yán)重抑制,轉(zhuǎn)而以糖酵解過程為主要供能來源[17],導(dǎo)致肌肉組織中丙酮酸、乳酸的大量累積,血漿乳酸水平上升,加重機體疲勞感,所以乳素的含量可以表明機體的疲勞程度。運動后即刻,核糖復(fù)方的乳酸含量顯著低于生理鹽水組,說明核糖復(fù)方抗疲勞的作用最明顯。小鼠恢復(fù)24 h后,核糖及其核糖復(fù)方組的乳酸顯著低于生理鹽水組,說明疲勞后恢復(fù)期,D-核糖及其復(fù)方可以加快機體的乳酸清除速度,提高乳酸的清除能力,防止乳酸堆積,從而有利于運動后機體的體力恢復(fù)。

表3 各組小鼠乳酸含量的比較±s,n=10)

2.5 對小鼠尿素氮的影響

由表4可知,運動后即刻,與生理鹽水組比較,D-核糖組出現(xiàn)極顯著降低(p<0.01);核糖復(fù)方組出現(xiàn)顯著下降;人參瑪咖組沒有顯著性變化。與核糖復(fù)方組比較,人參瑪咖組與核糖組無顯著性差異。運動后24 h,D-核糖組的血清尿素氮含量出現(xiàn)極顯著降低(p<0.01);核糖復(fù)方組出現(xiàn)顯著下降(p<0.05);人參瑪咖組沒有顯著性變化。與核糖復(fù)方組比較,人參瑪咖組極顯著(p<0.01)高于核糖復(fù)方組;核糖組顯著性(p<0.05)低于核糖復(fù)方組。

表4 各組小鼠尿素氮的比較

機體疲勞時,機體不能通過糖代謝和脂肪代謝產(chǎn)生足夠能量,會引起蛋白質(zhì)代謝增加[18],蛋白質(zhì)降解、脫氨基作用加強,使進入肝臟鳥氨酸循環(huán)的氨增多[19],從而導(dǎo)致血漿尿素氮水平上升,所以尿素氮的含量是機體疲勞狀態(tài)的指標(biāo)之一。本實驗中,運動后即刻核糖及其核糖復(fù)方組尿素氮含量顯著降低,說明在運動期間核糖可以降低機體蛋白質(zhì)的分解速度的作用,降低疲勞對機體的不利影響;人參瑪咖復(fù)方在降低尿素氮含量的作用上不明顯。運動后24 h,核糖組的尿素氮平均含量由3.39 mmol/L下降到2.85 mmol/L,說明核糖還具有一定清除血清尿素氮的作用,核糖復(fù)方組的清除速度顯著低于核糖組的清除速度,但依然與生理鹽水組有顯著性差異,可能是由于測量誤差引起。

3 結(jié)論

本實驗成功的建立了一個小鼠運動疲勞模型,各組小鼠均出現(xiàn)了運動性疲勞。在第一周負(fù)重游泳實驗中,核糖復(fù)方組與核糖組小鼠游泳力竭時間顯著高于人參瑪咖組及生理鹽水組。隨著小鼠機體的進一步疲勞,D-核糖的作用不在顯著,人參瑪咖復(fù)方的抗疲勞功效逐漸體現(xiàn)。實驗結(jié)果證實對急性疲勞中的小鼠,D-核糖具有明顯的抗疲勞作用;對長期疲勞的小鼠,D-核糖沒有表現(xiàn)出明顯的抗疲勞作用。核糖復(fù)方在兩種疲勞狀態(tài)下均具有良好的功效,其總體效果優(yōu)于人參瑪咖復(fù)方及核糖單方的抗疲勞功效,其可能通過提高機體內(nèi)的肝糖原儲備,降低血清尿素氮含量及減少乳酸堆積來作用于機體,產(chǎn)生一定的抗疲勞效果,有關(guān)其抗疲勞機理還需要進一步探討。本實驗結(jié)果為更有效的利用D-核糖,以及開發(fā)核糖相關(guān)的抗疲勞功能產(chǎn)品提供了一定的實驗基礎(chǔ)和理論根據(jù)。

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Study on anti-fatigue effect of compound D-ribose on mice

YUAN Bao-hui,LIU Gui-qin,LIU Min,LI Da-cheng,HAN Jun,WANG Zheng-ping

(Laboratory of Clinical Nutrition,Liaocheng University,Liaocheng 252000,China)

In this study,80 male mice were examined over a 4-week period of daily gavage feeding to study the effects of D-ribose compounds on the ability of mice to withstand fatigue. The mice were randomly divided into the saline control group,the ribose group,the ginseng and maca group,and the ribose compounds group. Each group was given the appropriate intervening measures,and the mice were evaluated at 0 hours and 24 hours after their movements to measure changes in lactic acid,urea nitrogen,and liver glycogen. The results showed that D-ribose and ribose compounds,during periods of extreme fatigue,could significantly extend the swimming time of mice(p<0.05),and that ribose compounds could increase liver glycogen(p<0.01)and decrease lactic acid(p<0.01)and urea nitrogen concentration(p<0.05). The results also confirmed that the compound d-ribose was better than the D-ribose or the ginseng and maca group in general terms and during period of extreme fatigue in mice,D-ribose and ribose compounded clearly possess anti-fatigue properties. With regards to long-term fatigue,D-ribose did not show clear anti-fatigue uses.

mice;anti-fatigue;D-ribose;ginseng;maca;D-ribose compounds

2016-06-13

袁保輝(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)學(xué)，E-mail：lcuyuanbaohui@163.com。

*通訊作者:王正平(1961-)，女，教授，研究方向：臨床營養(yǎng)，E-mail：bioactiveschina@163.com。

聊城市科技計劃項目(2013 GJH15)；聊城大學(xué)科技項目(318011405)；聊城大學(xué)大學(xué)生科技文化創(chuàng)新基金項目(26312158809)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)22-0349-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.060