吳一凡，林晟豪，許文濤，*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系，食品精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083

生物體及環(huán)境中的小分子化合物主要指輔因子、氨基酸、嘌呤、磷酸化糖、金屬離子等，它們?cè)诩?xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞防御機(jī)制等生化過(guò)程中具有重要的作用[1]。目前，對(duì)于小分子化合物的檢測(cè)技術(shù)較為成熟，主要包括色譜法、質(zhì)譜法、熒光法、紫外-可見(jiàn)光譜法及生物傳感器等。其中，生物傳感器具有選擇性高、成本低、操作簡(jiǎn)單、便攜等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，擁有巨大的市場(chǎng)份額，且已進(jìn)一步應(yīng)用于合成生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[2]，應(yīng)用前景廣闊[3]。然而在實(shí)際應(yīng)用中，傳統(tǒng)檢測(cè)方法涉及到大型儀器，存在成本高、操作復(fù)雜等不足，基于酶、抗體、微生物的傳感器同樣存在成本高、穩(wěn)定性欠佳、應(yīng)用范圍有限等缺點(diǎn)[4]。基于核糖開(kāi)關(guān)（riboswitch）的生物傳感器的出現(xiàn)為小分子檢測(cè)提供了一條新途徑。

核糖開(kāi)關(guān)作為一種34～200 bp 的結(jié)構(gòu)化的非編碼核酸，位于mRNA 的5 '非編碼區(qū)（5'UTR）或3'非編碼區(qū)（3'UTR），可以不依賴于蛋白質(zhì)發(fā)揮作用，通過(guò)與配體特異性結(jié)合，導(dǎo)致適體域構(gòu)象改變，并將變化信號(hào)傳遞給表達(dá)平臺(tái)域，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)[5-8]。早在1997 年，Gold 等[9-10]推測(cè)某些mRNA 可以直接感知小分子濃度的變化，并對(duì)這一變化做出響應(yīng)。而1999 年，Gelfand 等[11]在枯草芽孢桿菌核黃素操縱子上游發(fā)現(xiàn)1 個(gè)可以折疊成具有5 個(gè)發(fā)夾的保守結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)被證明能夠影響芽孢桿菌屬中核黃素基因的表達(dá)，由此推測(cè)其可能是1 個(gè)核糖核酸調(diào)控元件。2002 年Winkler 等[12]在大腸桿菌（Escherichia coli）中發(fā)現(xiàn)某些mRNA 能夠感知代謝物從而控制基因，這是證實(shí)mRNA 表達(dá)的第1 個(gè)實(shí)驗(yàn)性證據(jù)，其中編碼大腸桿菌中參與維生素B1生物合成酶的mRNA，可以與硫氨酸或其焦磷酸衍生物結(jié)合，而不需要蛋白質(zhì)參與，因此，將此mRNA 命名為核糖開(kāi)關(guān)。

目前發(fā)現(xiàn)的多數(shù)天然核糖開(kāi)關(guān)主要存在于細(xì)菌中，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了40 多種不同類型的細(xì)菌核糖開(kāi)關(guān)[13]。此外，植物、真菌等真核生物中也存在核糖開(kāi)關(guān)，主要以硫胺素焦磷酸核糖開(kāi)關(guān)為主，但哺乳動(dòng)物中尚未發(fā)現(xiàn)核糖開(kāi)關(guān)[14]。

核糖開(kāi)關(guān)作為一種功能核酸，具備高親和力、高特異性、較強(qiáng)的可編程性、可操作性和可重復(fù)性，能夠響應(yīng)多種內(nèi)源性小分子代謝物及非內(nèi)源性小分子。因此，基于核糖開(kāi)關(guān)的生物傳感器具有廣泛應(yīng)用于小分子檢測(cè)、跟蹤小分子代謝物等方向的潛力。本文對(duì)核糖開(kāi)關(guān)的來(lái)源、構(gòu)成、調(diào)控機(jī)制、篩選，特別是對(duì)小分子靶標(biāo)的核糖開(kāi)關(guān)的生物傳感器分類進(jìn)行了介紹，旨在拓展核糖開(kāi)關(guān)的新型應(yīng)用領(lǐng)域。

1 核糖開(kāi)關(guān)

1.1 核糖開(kāi)關(guān)的構(gòu)成與調(diào)控機(jī)制

在結(jié)構(gòu)上，核糖開(kāi)關(guān)由進(jìn)化保守的適體結(jié)構(gòu)域和可變表達(dá)平臺(tái)兩部分組成[15]。適體結(jié)構(gòu)域高度保守，因具有高親和力和特異性，可結(jié)合多種配體，如輔酶、金屬陽(yáng)離子、陰離子、核苷酸及其衍生物、氨基酸、磷酸化糖等[16]；表達(dá)平臺(tái)則調(diào)節(jié)下游編碼序列，控制基因表達(dá)。核糖開(kāi)關(guān)的調(diào)控機(jī)制通常有3種：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控以及自身剪切作用調(diào)控[17]。

在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)節(jié)是核糖開(kāi)關(guān)最常見(jiàn)的作用機(jī)制之一（圖1A）。由一個(gè)莖和一系列尿苷殘基構(gòu)成了一個(gè)內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄終止子，導(dǎo)致RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄停止并釋放DNA 模板和RNA 產(chǎn)物。而配體與適體的結(jié)合則會(huì)導(dǎo)致抗終止子的形成，從而控制終止子的形成[18]。Barrick 等[19]基于二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的計(jì)算方法，選取結(jié)構(gòu)和解離常數(shù)已知的茶堿適體，連接下游序列，使得適體結(jié)構(gòu)的30%交替成為終止子莖的一部分，設(shè)計(jì)合成茶堿核糖開(kāi)關(guān)。

在翻譯水平調(diào)控中，核糖開(kāi)關(guān)可以通過(guò)互斥的堿基配對(duì)結(jié)構(gòu)控制核糖體進(jìn)入核糖體結(jié)合位點(diǎn)或SD（shine-dalgarno）序列，激活或者終止翻譯[8]（圖1B）。當(dāng)核糖體結(jié)合到SD 序列上，則翻譯進(jìn)行；若適體與配體結(jié)合，阻止核糖體與SD 序列結(jié)合，則翻譯終止[20]。Borujeni 等[21]通過(guò)統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)模型，對(duì)激活基因表達(dá)的翻譯調(diào)節(jié)核糖開(kāi)關(guān)的序列-結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并利用該模型對(duì)62個(gè)合成核糖開(kāi)關(guān)進(jìn)行了自動(dòng)計(jì)算設(shè)計(jì)。

核糖開(kāi)關(guān)的另一種作用機(jī)制則是通過(guò)自身選擇性剪切作用和改變mRNA 穩(wěn)定性進(jìn)行基因調(diào)控，這其中涉及到核酶的切割活性（圖1C）。谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶GlmS 核糖開(kāi)關(guān)作為其中的一種核酶，其配體為葡糖胺-6-磷酸（GlcN6P）。當(dāng)GlcN6P 與核糖開(kāi)關(guān)結(jié)合后，可激活核酶活性，啟動(dòng)降解，從而快速破壞基因的mRNA[21]。

圖1 核糖開(kāi)關(guān)的調(diào)控機(jī)制[23]Fig.1 The regulation mechanism of riboswitches[23]

1.2 核糖開(kāi)關(guān)的篩選

1990 年，Ellington 等[22]體外篩選出與各種有機(jī)染料可以特異性結(jié)合的隨機(jī)序列RNA 分子，并將其命名為“適體”。大約每1010個(gè)隨機(jī)序列的RNA 分子中存在1個(gè)可以與某種小分子配體進(jìn)行特異性結(jié)合的位點(diǎn)。體外篩選核糖開(kāi)關(guān)通常以適體作為核心組件，利用配體指數(shù)級(jí)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得[23]。SELEX 體外篩選技術(shù)主要包括建立文庫(kù)、與靶標(biāo)物質(zhì)孵育、洗脫分離、擴(kuò)增富集等步驟[24]。迄今為止，已通過(guò)SELEX 方法篩選獲得了多種適體。這一成熟的適體體外篩選方法同樣適用于人工適體的核糖開(kāi)關(guān)設(shè)計(jì)與篩選，具有開(kāi)發(fā)出與多種小分子靶標(biāo)結(jié)合的核糖開(kāi)關(guān)的潛力。

理論上這些適體與天然核糖開(kāi)關(guān)中的適體同樣具有高親和力和特異性結(jié)合的性質(zhì)[25]。然而，僅有有限數(shù)量的適體可以最終進(jìn)行核糖開(kāi)關(guān)開(kāi)發(fā)，如茶堿適體[26-27]、四環(huán)素結(jié)合適體[28-30]。這是由于體外篩選得到的適體無(wú)法保證體內(nèi)功能[31]。

與體外篩選系統(tǒng)相比，體內(nèi)篩選系統(tǒng)能夠基于細(xì)胞復(fù)雜的生理環(huán)境，對(duì)進(jìn)入細(xì)胞的化合物進(jìn)行篩選。大多數(shù)經(jīng)過(guò)體外篩選得到的核糖開(kāi)關(guān)需要進(jìn)一步經(jīng)過(guò)體內(nèi)遺傳篩選后，才能夠得到具有所需功能的核糖開(kāi)關(guān)[32-33]。遺傳篩選可以通過(guò)細(xì)胞表型鑒定細(xì)胞中生物分子的功能[34]。Nomura等[35]基于大腸桿菌，通過(guò)雙重遺傳選擇，從75 000個(gè)克隆中成功篩選出功能性硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate，TPP）核糖開(kāi)關(guān)，其可以在TPP 作用下調(diào)控下游基因tet A的表達(dá)。當(dāng)tet A基因在大腸桿菌中被有效表達(dá)，大腸桿菌對(duì)四環(huán)素具有耐性，但對(duì)氯化鎳敏感；反之，當(dāng)tet A基因不表達(dá)，大腸桿菌對(duì)四環(huán)素敏感，但對(duì)氯化鎳具有耐性。

傳統(tǒng)的遺傳篩選方法雖然可以成功地篩選出具有功能性的核糖開(kāi)關(guān)，但仍存在背景表達(dá)水平高、激活指數(shù)不理想等問(wèn)題，因此，體內(nèi)遺傳篩選方法需要進(jìn)一步優(yōu)化。Lynch 等[36]提出了一種自動(dòng)化的高通量篩選方法，該方法可以鑒定合成的核糖開(kāi)關(guān)的生物活性。在缺乏所需配體的情況下，這些核糖開(kāi)關(guān)顯示出極低的基因表達(dá)背景水平，而在有配體存在的情況下，這些核糖開(kāi)關(guān)的表達(dá)顯著增加。Kirchner 等[37]利用一種高通量體內(nèi)篩選系統(tǒng)，檢測(cè)1 280個(gè)大型文庫(kù)中來(lái)自炭疽桿菌的鳥(niǎo)嘌呤核糖開(kāi)關(guān)，并鑒定出影響核糖開(kāi)關(guān)介導(dǎo)的基因調(diào)控的配體化合物。

2 小分子靶標(biāo)的核糖開(kāi)關(guān)生物傳感器的功能

生物傳感器由分子識(shí)別元件、傳感器和報(bào)告模塊組成[38]。當(dāng)目標(biāo)分析物質(zhì)通過(guò)擴(kuò)散作用被分子識(shí)別元件識(shí)別后，即與分子識(shí)別元件發(fā)生特異性結(jié)合，并產(chǎn)生生物學(xué)信息，該信息經(jīng)過(guò)傳感器轉(zhuǎn)換為可測(cè)量的信號(hào)，隨后經(jīng)過(guò)報(bào)告模塊的放大和處理，最終以可視化方式顯示檢測(cè)結(jié)果，從而達(dá)到分析目標(biāo)物質(zhì)的目的[39]。生物傳感器按照分子識(shí)別元件可以分為酶、抗體、細(xì)胞、微生物、脫氧核糖核酸、核糖核酸等；而生物傳感器的信號(hào)輸出多數(shù)為熒光、電信號(hào)以及能夠直接影響宿主菌生長(zhǎng)的抗性因子或限制因子。

近年來(lái)，核糖開(kāi)關(guān)作為一種識(shí)別元件，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器，與傳統(tǒng)其他傳感器相比，優(yōu)勢(shì)更明顯（表1）。核糖開(kāi)關(guān)是一類功能核酸，具有可編程性、可操作性和可重復(fù)性，這使其能夠依據(jù)實(shí)際需求組裝拼接調(diào)控元件，并對(duì)其進(jìn)行合理設(shè)計(jì)與優(yōu)化?；诖耍颂情_(kāi)關(guān)具有識(shí)別特定的代謝物（如包括輔因子在內(nèi)的多種配體、嘌呤及其衍生物、氨基酸、磷酸化糖和金屬離子[40]）和擴(kuò)大可檢測(cè)配體多樣性的潛力?；诤颂情_(kāi)關(guān)的生物傳感器，最常見(jiàn)的信號(hào)輸出系統(tǒng)為蛋白質(zhì)水平的報(bào)告系統(tǒng)，如綠色熒光蛋白及其變體[41]等；同時(shí)，還存在一類熒光核酸適體也可以作為報(bào)告劑使用，如菠菜適體[42-46]、花椰菜適體[47]及芒果適體[48]。此外，也可以通過(guò)使用抗生素抗性的基因進(jìn)行生長(zhǎng)依賴性分析，如通過(guò)四環(huán)素抗性基因tetA進(jìn)行陰性或陽(yáng)性的選擇[49]。

表1 不同類別生物傳感器的特點(diǎn)Table 1 The characteristics of different types of biosensors

2.1 輔因子

2.1.1 硫胺素焦磷酸 硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate，TPP）作為碳水化合物和氨基酸代謝中各種代謝中間產(chǎn)物羧化和脫羧的必要輔因子。TPP 核糖開(kāi)關(guān)是最普遍且豐富的一種核糖開(kāi)關(guān)，同樣也是唯一在真核生物中存在的核糖開(kāi)關(guān)，包括真菌[50-51]、藻類[52]和植物[53]。其可以參與調(diào)節(jié)TPP 的基因表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)mRNA 衰減、Rho 依賴性轉(zhuǎn)錄終止、交替剪接[54]。Aghdam 等[55]比較了來(lái)源于Alishewanella tabrizica、Alishewanella aestuarii、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的TPP適體結(jié)構(gòu)域，對(duì)其親和力進(jìn)行分析，最終證明Alishewanella tabrizica、Alishewanella aestuarii的TPP 結(jié)合親和力最高，是功能性的TPP 核糖開(kāi)關(guān)。此外，TPP 核糖開(kāi)關(guān)還可以作為抗菌藥物靶點(diǎn)。Pavlov 等[56]基于生物信息學(xué)分析，根據(jù)核糖開(kāi)關(guān)作為抗菌藥物靶點(diǎn)的適宜性對(duì)其進(jìn)行分組，研究得到TPP 可作為抗菌藥物靶點(diǎn)，抑制TPP 核糖開(kāi)關(guān)將阻礙某些致病菌的生長(zhǎng)。

2.1.2 S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAM）SAM 作為生物體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物，是由甲硫氨酸和ATP 通過(guò)SAM 合成酶合成的。SAM 在細(xì)胞代謝中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，是已知最常見(jiàn)的核糖開(kāi)關(guān)效應(yīng)因子[57]。作為已知最大的核糖開(kāi)關(guān)組，SAM核糖開(kāi)關(guān)已經(jīng)確定了SAM-Ⅰ超家族、SAM-Ⅱ超家族、SAM-Ⅲ家族，這3個(gè)不同的SAM 核糖開(kāi)關(guān)超家族是自然界中最常見(jiàn)的核糖開(kāi)關(guān)類別，在某種程度上構(gòu)成了結(jié)構(gòu)化核糖核酸的整體。Tang 等[58]通過(guò)體內(nèi)外研究表明，野油菜黃單胞菌中SAM-ⅠXcc核糖開(kāi)關(guān)在黃單胞菌中高度保守，具有雙重功能表達(dá)平臺(tái)，主要在翻譯水平上利用Met 操縱子調(diào)節(jié)甲硫氨酸的合成，以響應(yīng)細(xì)胞中SAM水平。

2.2 嘌呤及其衍生物

嘌呤核糖開(kāi)關(guān)于2003 年被發(fā)現(xiàn)，是最具特征的核糖開(kāi)關(guān)之一。這類核糖開(kāi)關(guān)可以分為4 類，分別與腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷和3類高度修飾的鳥(niǎo)嘌呤（prequeuosine，preQ1）結(jié)合[59]。其中，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤核糖開(kāi)關(guān)盡管結(jié)合不同的代謝物，且具有不同的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，但是其適體結(jié)構(gòu)域具有高度的結(jié)構(gòu)相似性，結(jié)合口袋幾乎相同[60]。

在多種核糖開(kāi)關(guān)中，add 型腺嘌呤核糖開(kāi)關(guān)是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的核糖開(kāi)關(guān)之一[61]。腺嘌呤核糖開(kāi)關(guān)是目前罕見(jiàn)的具有激活基因表達(dá)作用的核糖開(kāi)關(guān)[62]。對(duì)于腺苷敏感的創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificusadd）核糖開(kāi)關(guān)，其與配體結(jié)合時(shí)可以調(diào)控腺嘌呤脫氨酶翻譯的啟動(dòng)；反之，若缺乏腺嘌呤，則會(huì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)阻止SD 序列與核糖體結(jié)合以抑制翻譯起始[63]。

鳥(niǎo)嘌呤核糖開(kāi)關(guān)分布廣泛，主要存在于金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌基因中[64]。其結(jié)合口袋可以識(shí)別配體小分子，通過(guò)局部構(gòu)象變化以及Watson-Crick 堿基配對(duì)的相互作用，從而將配體完全包裹在內(nèi)[65]。與腺嘌呤核糖開(kāi)關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制相反，鳥(niǎo)嘌呤核糖開(kāi)關(guān)作為一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，通過(guò)抑制基因的表達(dá)從而對(duì)細(xì)菌病原體代謝和運(yùn)輸進(jìn)行調(diào)控。因此，鳥(niǎo)嘌呤核糖開(kāi)關(guān)被認(rèn)為具有成為新型抗菌化合物的潛力。Kim 等[66]研究發(fā)現(xiàn)，鳥(niǎo)嘌呤類似物G7 可以抑制枯草芽孢桿菌中由鳥(niǎo)嘌呤核糖開(kāi)關(guān)調(diào)控的報(bào)告基因的表達(dá)，表明G7可能通過(guò)調(diào)控鳥(niǎo)嘌呤核糖開(kāi)關(guān)進(jìn)而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。Yan 等[67]通過(guò)測(cè)量鳥(niǎo)嘌呤類似物對(duì)艱難梭菌（Clostridium difficile）中的鳥(niǎo)嘌呤核糖開(kāi)關(guān)的親和力以及其結(jié)構(gòu)-活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)嘌呤核糖開(kāi)關(guān)能夠調(diào)節(jié)嘌呤化合物的基礎(chǔ)代謝，進(jìn)而確定了鳥(niǎo)嘌呤核糖開(kāi)關(guān)幾種鳥(niǎo)嘌呤類似物的抗菌活性。

2.3 氨基酸

在目前發(fā)現(xiàn)的40 類核糖開(kāi)關(guān)中，僅3 種核糖開(kāi)關(guān)可以調(diào)節(jié)遺傳編碼的氨基酸濃度，分別為甘氨酸、賴氨酸和谷氨酰胺。其中1 個(gè)重要的調(diào)節(jié)途徑涉及到賴氨酸核糖開(kāi)關(guān)，其可指導(dǎo)賴氨酸自身以及賴氨酸和其他氨基酸前體物質(zhì)的生物合成和運(yùn)輸[68]。賴氨酸是所有生物的必需氨基酸，因此其生物合成途徑具有至關(guān)重要的意義。Mukherjee 等[69]通過(guò)對(duì)所有原核生物中賴氨酸核糖開(kāi)關(guān)的分布進(jìn)行基因組學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)賴氨酸核糖開(kāi)關(guān)在厚壁菌門和γ變形菌中分布最為豐富，并揭示了通過(guò)核糖開(kāi)關(guān)進(jìn)行賴氨酸調(diào)控的模式，其主要存在于生物合成基因的上游，這有利于未來(lái)將核糖開(kāi)關(guān)運(yùn)用于靶向治療。

2.4 磷酸化糖

GlmS 核糖開(kāi)關(guān)廣泛存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中，其作為1 種位于GlmS基因的5'非翻譯區(qū)的自剪切核酶，可以催化GlcN6P的合成[70]。GlcN6P是細(xì)菌細(xì)胞壁的重要組成部分，當(dāng)GlcN6P 與GlmS 核糖開(kāi)關(guān)結(jié)合后，可以誘導(dǎo)GlmS核糖開(kāi)關(guān)發(fā)生自剪切，抑制下游基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致mRNA 的不穩(wěn)定，由此形成不穩(wěn)定的細(xì)胞壁，限制了細(xì)菌的生長(zhǎng)[71-73]。因此，GlmS 核糖開(kāi)關(guān)同樣具有開(kāi)發(fā)針對(duì)各種病原菌藥物的潛力。Luense 等[72]發(fā)現(xiàn)了1 種新的GlcN6P的碳類似物，可以激活金黃色葡萄球菌中的GlmS 核糖開(kāi)關(guān)，其效力與天然GlcN6P 相同，但僅在高濃度下誘導(dǎo)的GlmS核糖開(kāi)關(guān)發(fā)生自剪切，從而發(fā)揮抗菌作用。

2.5 金屬離子

金屬離子作為多種酶的輔因子，在生物學(xué)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。然而，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)金屬離子濃度超過(guò)一定閾值，細(xì)胞毒性也隨之增加[74]。因此，細(xì)胞內(nèi)的金屬離子需受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)。除了多數(shù)細(xì)菌通過(guò)非編碼核糖核酸進(jìn)行反式作用調(diào)節(jié)外，研究表明，某些細(xì)菌可以利用順式調(diào)控作用RNA 元件核糖開(kāi)關(guān)調(diào)控金屬離子穩(wěn)態(tài)，其中，Mg2+核糖開(kāi)關(guān)是最常見(jiàn)的[75]。Dann 等[76]在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)參與Mg2+調(diào)控的金屬感應(yīng)核糖開(kāi)關(guān)，命名為M-box，其可發(fā)揮關(guān)閉開(kāi)關(guān)的作用，當(dāng)Mg2+與Mg2+核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，下游基因內(nèi)會(huì)形成轉(zhuǎn)錄終止子，這可能是調(diào)控細(xì)菌中金屬離子水平的一種常見(jiàn)模式。此外，還存在Ni2+、Co2+、Mn2+核糖開(kāi)關(guān)，這種核糖開(kāi)關(guān)及其天然配體分布于多種細(xì)菌中，可能作為相應(yīng)金屬離子毒性濃度的傳感器[13]。

2.6 其他小分子

除上述涉及的幾類小分子化合物，目前所發(fā)現(xiàn)的最為顯著的核糖開(kāi)關(guān)之一是氟化物核糖開(kāi)關(guān)。2010 年，Weinberg 等[77]在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)1 種結(jié)合配體未知的核糖開(kāi)關(guān)。隨后，Baker等[78]發(fā)現(xiàn)這一類核糖開(kāi)關(guān)可以選擇性地結(jié)合氟化物，激活編碼氟化物運(yùn)輸工具、被氟化物抑制的酶及其他蛋白質(zhì)的基因表達(dá)，進(jìn)而減輕自然界中氟離子的有害影響。因此，根據(jù)這一作用機(jī)制，可以有效檢測(cè)和控制氟離子的毒性水平。

3 展望

自2002 年初次發(fā)現(xiàn)核糖開(kāi)關(guān)以來(lái)，其作為一種新型調(diào)控基因表達(dá)的方式已經(jīng)近20 年，在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。合成核糖開(kāi)關(guān)是極具前途的工具，目前已將其應(yīng)用于代謝工程、合成生物學(xué)等領(lǐng)域?；谛》肿影袠?biāo)的核糖開(kāi)關(guān)的生物傳感器具有多種優(yōu)勢(shì)，是檢測(cè)小分子的有力工具，我們?cè)诤颂情_(kāi)關(guān)的篩選、裁剪、理性設(shè)計(jì)等幾個(gè)方向提出以下展望。

①開(kāi)發(fā)核糖開(kāi)關(guān)的高通量篩選及裁剪系統(tǒng)。核糖開(kāi)關(guān)未來(lái)可以通過(guò)高通量篩選的方法，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更多的核糖開(kāi)關(guān)，與此同時(shí)，通過(guò)裁剪進(jìn)一步提高核糖開(kāi)關(guān)的識(shí)別特異性及親和力。

②體外篩選核糖開(kāi)關(guān)的體內(nèi)環(huán)境適用性改造。經(jīng)過(guò)體外篩選所得的適體，僅有少數(shù)核糖開(kāi)關(guān)能保證在細(xì)胞內(nèi)性能和功能的穩(wěn)定性，未來(lái)可以通過(guò)高通量自動(dòng)化體內(nèi)篩選技術(shù)，輔以計(jì)算機(jī)等新型手段，有望突破傳統(tǒng)遺傳篩選與體外篩選的局限性。

③核糖開(kāi)關(guān)的計(jì)算機(jī)輔助理性設(shè)計(jì)?，F(xiàn)階段對(duì)于設(shè)計(jì)核糖開(kāi)關(guān)的方法還未完全了解，計(jì)算輔助熱力學(xué)建模仍存在一定局限性，未來(lái)可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更有效的方法進(jìn)行計(jì)算設(shè)計(jì)與優(yōu)化。

④核糖開(kāi)關(guān)識(shí)別與發(fā)光功能核酸信號(hào)輸出的有機(jī)整合。目前核糖開(kāi)關(guān)信號(hào)輸出主要以熒光蛋白和熒光核酸適體為主，未來(lái)可以進(jìn)一步豐富核糖開(kāi)關(guān)的信號(hào)輸出系統(tǒng)。

⑤核糖開(kāi)關(guān)無(wú)細(xì)胞傳感器開(kāi)發(fā)。目前已有研究表明，無(wú)細(xì)胞傳感器使得核糖開(kāi)關(guān)小分子靶標(biāo)的出入細(xì)胞器不受限制[79]，具有極易調(diào)節(jié)反應(yīng)環(huán)境的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)，同時(shí)具備便攜、低成本、操作簡(jiǎn)便、可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存等特性，這對(duì)于未來(lái)針對(duì)小分子靶標(biāo)的快速檢測(cè)具有極大的應(yīng)用潛力。