王明利，周珍輝，張 浩

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系 102442）

1 項(xiàng)目研究背景、目的與意義

初生犢牛的主動(dòng)免疫系統(tǒng)尚未成熟，處在發(fā)育階段，同時(shí)，由于牛胎盤結(jié)構(gòu)的特殊性結(jié)構(gòu)，母源性抗體難以通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒血液循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致犢牛出生前沒有獲得被動(dòng)免疫能力[1]，因此，剛出生的犢牛對外界任何病原微生物的抵抗力幾乎是零抵抗。初乳，即奶牛分娩后第一次擠出的乳，含有豐富的免疫球蛋白，也就是母源性抗體，初乳中含有如胰島素等生物活性物質(zhì)、激素及生長因子[2]，是初生犢牛在產(chǎn)后2個(gè)月健康成長、建立被動(dòng)免疫系統(tǒng)唯一物質(zhì)。犢牛出生后對免疫球蛋白的吸收與時(shí)間關(guān)系密切相聯(lián)，最初幾個(gè)小時(shí)免疫球蛋白的吸收率最高，平均為30%，而隨著時(shí)間的延長免疫球蛋白的吸收率急劇下降，尤其出生24h后無法吸收完整的免疫球蛋白抗體。如果犢牛出生24h飼喂初乳，那么將導(dǎo)致50%以上的犢牛因缺乏免疫力而難以成活[3]。充足高質(zhì)量初乳可以幫助新生犢牛盡快建立起被動(dòng)免疫系統(tǒng)，從而提高成活率、增加日體重。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)[4]。

免疫膠體金技術(shù)隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展而快速發(fā)展，免疫膠體金技術(shù)具有操作簡單、快速出結(jié)果且結(jié)果易于判定、特異性好、不需要任何復(fù)雜的儀器、適用現(xiàn)場操作等特點(diǎn)，所以廣泛地應(yīng)用在獸醫(yī)臨床診斷中，本研究旨在建立免疫膠體金技術(shù)檢測初乳中免疫球蛋白含量的快速測定方法，并在奶牛生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

2 主要研究內(nèi)容及預(yù)期目標(biāo)

2.1 主要研究內(nèi)容

2.1.1 兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制備及抗體的純化

試驗(yàn)兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制備包括兔的免疫及血清分離；抗體純化包括DEAE-纖維素的活化、裝柱、加樣、洗脫和測定[4]。

2.1.2 免疫膠體金技術(shù)檢測初乳免疫球蛋白方法的推廣應(yīng)用

將通過上述步驟建立的免疫膠體金測定初乳免疫球蛋白方法在奶牛場推廣應(yīng)用，進(jìn)一步摸索應(yīng)用條件和檢測條件，并制定相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 免疫膠體金檢測牛初乳免疫球蛋白含量方法的建立

2.2.1 膠體金顆粒制備采用檸檬酸三鈉還原法 用超純水把1%氯金酸溶液稀釋100倍，濃度為0.01%，用微量移液器吸取0.01%氯金酸溶液50mL于三角瓶，置于電熱板煮沸，準(zhǔn)確量取一定量1%檸檬酸三鈉溶液加入三角瓶中，輕輕搖勻繼續(xù)煮沸，直至氯金酸溶液由藍(lán)色變成紅色，繼續(xù)加熱4min[5]。冷卻至室溫加超純水至原體積，無菌密封保存。在電鏡下觀察，如果顆粒大小均勻、近似圓形，說明制作的膠體金顆粒合格，通過調(diào)節(jié)l%檸檬酸三鈉的用量，實(shí)現(xiàn)直徑為2Onm的膠體金制備。

2.2.2 膠體金標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)牛免疫球蛋白的制備 通過試管法確定蛋白最小標(biāo)記量以及膠體金標(biāo)記蛋白最適宜的pH值[6]。將標(biāo)準(zhǔn)牛免疫球蛋白溶液加入膠體金溶液中，加入終濃度的牛血清白蛋白。采用超速低溫離心法純化金標(biāo)蛋白[7]。

2.2.3 檢測膜片的制備 用包被緩沖液把兔抗牛免疫球蛋白稀釋成6種不同濃度，在每個(gè)硝酸纖維素膜片上選擇6個(gè)不同的點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)滴10μL，室溫陰干，在封閉液中封閉2h，再用PBS洗滌2次[8]，室溫陰干，4℃保存?zhèn)溆?。將包被好的硝酸纖維素膜與金標(biāo)蛋白反應(yīng)，觀察硝酸纖維素膜上點(diǎn)的顏色，確定硝酸纖維素膜膜上抗體最佳包被濃度[9]。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)參照物的制備 將檢測膜片分別與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛免疫球蛋白反應(yīng)洗滌。取出用濾紙吸干，再與金標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)牛免疫球蛋白反應(yīng)5min后洗滌[10]。觀察與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛免疫球蛋白反應(yīng)的硝酸纖維素膜膜上紅色點(diǎn)的個(gè)數(shù)及顏色深淺變化，作為標(biāo)準(zhǔn)參照樣以判定待檢樣品的濃度[9]。

2.2.5 樣品的檢測 將牛初乳樣品離心，取中間層，將乳清適當(dāng)稀釋與檢測膜片反應(yīng)。取出膜片洗滌，再與金標(biāo)蛋白反應(yīng)，與標(biāo)準(zhǔn)參照物對比[11]，確定待測樣品的濃度。

2.3 預(yù)期目標(biāo)

本研究采用免疫膠體金技術(shù)測定牛初乳免疫球蛋白，通過試驗(yàn)建立起免疫膠體金半定量檢測牛初乳以及乳制品中免疫球蛋白含量的方法，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場、快速、簡便易行的牛場初乳免疫球蛋白含量測定。

3 研究方法、技術(shù)路線及實(shí)施方案

3.1 兔抗牛lgG抗血清的制備及抗體的純化

3.1.1 兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制備

第一次免疫用弗氏完全佐劑抗原，在兔子皮下選沒有重復(fù)的6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行注射，3周后進(jìn)行第二次注射，選擇弗氏不完全佐劑抗原注射，第4周進(jìn)行第3次注射，7d后采兔子耳靜脈血，測定血清效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)1∶16的效果，可以進(jìn)行心臟采血，分離血清，-20℃凍存[12]。

3.1.2 抗體純化

取1O deae-纖維素浸泡在1000 mL蒸餾水中攪勻，靜置、取細(xì)顆粒，用1000mL氫氧化鈉溶液洗滌大約1h，再用蒸餾水沖洗至pH值接近7，做為緩沖液備用，采用重力沉降的原理裝柱子，柱子選用直徑2cm，長20cm的玻璃柱。血清用洗脫緩沖液透析，微孔膜過濾，4℃離心，加樣，洗脫，測定獲取的蛋白的純度[13]。

3.2 免疫膠體金技術(shù)檢測初乳免疫球蛋白方法的推廣應(yīng)用

將通過上述步驟建立的免疫膠體金測定初乳免疫球蛋白方法在奶牛場推廣應(yīng)用，進(jìn)一步摸索應(yīng)用條件和檢測條件，并制定相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

4 重點(diǎn)、難點(diǎn)和創(chuàng)新之處

本研究將免疫膠體金技術(shù)引入定量測定牛初乳免疫球蛋白，通過試驗(yàn)建立起免疫膠體金半定量檢測牛初乳及制品中免疫球蛋白含量的方法，實(shí)現(xiàn)適合牛場現(xiàn)場、快速、簡便易行的牛場初乳免疫球蛋白含量測定。重點(diǎn)在于兔抗牛免疫球蛋白的制備和純化、膠體金標(biāo)記蛋白最適標(biāo)記量和最適PH值的確定、檢測膜片與金標(biāo)蛋白最佳反應(yīng)時(shí)間的確定等。

5 實(shí)現(xiàn)本項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)已具備的條件

作者近年來主要從事動(dòng)物性食品衛(wèi)生檢驗(yàn)的教學(xué)與研究工作，在奶牛營養(yǎng)代謝病的防治和犢牛健康保健技術(shù)方面做了較為廣泛的研究，對奶牛營養(yǎng)，特別是犢牛飼養(yǎng)管理方面的營養(yǎng)管理方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。

項(xiàng)目的實(shí)施依托“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系北京市奶牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)農(nóng)職院綜合試驗(yàn)站”和北京市奶牛產(chǎn)業(yè)科技資源站。近年來，項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)已承擔(dān)并完成多項(xiàng)項(xiàng)目研發(fā)與技術(shù)推廣工作。以北京農(nóng)職院為第一完成單位奶牛健康養(yǎng)殖技術(shù)創(chuàng)新與集成推廣”項(xiàng)目榮獲2013年度北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)。項(xiàng)目的“團(tuán)隊(duì)成員學(xué)歷層次高，學(xué)術(shù)背景好，研發(fā)能力強(qiáng)，專業(yè)涉及臨床獸醫(yī)、動(dòng)物營養(yǎng)等方面，完全有能力承擔(dān)并完成該項(xiàng)研究任務(wù)。項(xiàng)目申請單位已建立起專業(yè)化的“牛病診治實(shí)驗(yàn)室”平臺，有Bio-Rad酶標(biāo)儀、全自動(dòng)生化檢測儀、全自動(dòng)乳成分分析儀等設(shè)備。因此，本項(xiàng)目的實(shí)施具備了必須的儀器設(shè)備和試驗(yàn)條件。