高 穎

（朝陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所，遼寧 朝陽(yáng) 122300）

臨床中發(fā)病率較高的消化系統(tǒng)疾病之一即為腹瀉，臨床表現(xiàn)為排便次數(shù)增多且大便性狀改變，可分為急性腹瀉與慢性腹瀉兩種，急性腹瀉的致病原因包括感染、中毒、藥物及其他疾病，慢性腹瀉致病原因則為腸道疾病（感染及非感染性）、腫瘤、小腸吸收障礙、腸動(dòng)力異常、全身疾病及肝膽等組織器官疾病[1]。與其他類型腹瀉相比，感染性腹瀉的流行性較為廣泛，主要致病菌包括沙門菌與志賀菌兩類[2]。對(duì)感染性腹瀉予以治療前，首先需確定致病菌類型，才能準(zhǔn)確用藥，使治療及預(yù)后效果得以提高。對(duì)腹瀉致病菌予以檢測(cè)的傳統(tǒng)方法為常規(guī)細(xì)菌鑒定法，雖然有較高的檢出率，但操作步驟繁瑣及檢驗(yàn)期較長(zhǎng)，不具有靈敏度，同時(shí)易受外界其他因素的影響[3]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，臨床對(duì)于腸道致病菌的檢測(cè)多應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法，該方法對(duì)死細(xì)菌及活細(xì)菌均有較高的檢出率，且操作簡(jiǎn)便。本文對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與常規(guī)細(xì)菌鑒定法在腸道致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值予以分析。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2018年9月至2019年10月收治的360例腹瀉患者為研究對(duì)象，并對(duì)以上患者的糞便標(biāo)本予以采集。

1.2 方法 對(duì)所有患者糞便標(biāo)本均實(shí)施常規(guī)細(xì)菌鑒定法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。

常規(guī)細(xì)菌鑒定法：在肛拭子中應(yīng)用采樣器予以采取及增菌，采樣器必須為一次性，增菌時(shí)長(zhǎng)為18～24 h，增菌方法為于增菌液（志賀菌及沙門菌）中置入肛拭子。然后于XLD及SS瓊脂中用劃線法接種，并在37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)樣本于平板培養(yǎng)基中，對(duì)菌落變化進(jìn)行觀察及記錄；其次需對(duì)可疑菌落進(jìn)行選取，并實(shí)施涂片和染色處理，將其放置在顯微鏡下進(jìn)行觀看及檢測(cè)；另對(duì)可疑菌落予以選取，在經(jīng)涂片和染色處理后，實(shí)施氧化酶試驗(yàn)及觸酶試驗(yàn)，若有必要，還可將血清學(xué)凝聚試驗(yàn)應(yīng)用于以上標(biāo)本中，確保妥善完成鑒定工作[4]。最后應(yīng)用單價(jià)血清凝聚法及多價(jià)血清凝聚法判定取自于雙糖內(nèi)的細(xì)菌懸液。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法：實(shí)施3～5 h的增菌于肛拭子中，增菌液中需含有志賀菌及沙門菌，在1.5 mL無(wú)菌離心管中加入2滴增菌液，轉(zhuǎn)移液體滴管需為一次性，然后再將20人份肛拭子增菌液加入以上試管中，進(jìn)行3 min左右10000 r/min轉(zhuǎn)速的離心處理，將上清液予以最大限度移除，對(duì)50 μL底層液進(jìn)行檢測(cè)。將DNA提取液共5 μL加入底層液中并進(jìn)行觀察，直到沉淀懸浮現(xiàn)象出現(xiàn)后進(jìn)行5 min左右100 ℃煮沸，再予以3 min 10000 r/min轉(zhuǎn)速的離心，于干凈滅菌離心管中置入離心所得5 μL上清液[5]。使用25 μL反應(yīng)體系，將志賀菌VIC及沙門菌FAM作為檢測(cè)通道，實(shí)施擴(kuò)增后進(jìn)行一個(gè)94 ℃/3 min循環(huán)檢測(cè)，再進(jìn)行40個(gè)93 ℃/30 s～55 ℃/45 s的循環(huán)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將研究所得數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納整理，并將計(jì)數(shù)資料以[n（%）]的形式錄入SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

360份糞便標(biāo)本中，常規(guī)細(xì)菌鑒定法檢測(cè)出沙門菌14株，志賀菌6株，檢測(cè)陽(yáng)性率分別為3.89%及1.67%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)出沙門菌15株，志賀菌6株，檢測(cè)陽(yáng)性率分別為4.17%及1.67%。兩種檢測(cè)方法對(duì)沙門菌及志賀菌的檢測(cè)陽(yáng)性率比較，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。將實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)陽(yáng)性患者的糞便標(biāo)本再行常規(guī)細(xì)菌鑒定法檢測(cè)，陽(yáng)性率為100.00%。

3 討 論

腹瀉是一種常見且多發(fā)的疾病，可發(fā)生于任何年齡段的人群，患者臨床表現(xiàn)為大便次數(shù)增多及大便稀溏等癥狀[6]。感染性腹瀉的常見致病菌為志賀菌及沙門菌，傳播途徑包括消化道、飲用或進(jìn)食受污染的水源或食品，使患者生活質(zhì)量及身體健康受到不利影響[7-8]。對(duì)于感染性胃腸道疾病，臨床通常給予抗生素治療，考慮到抗生素應(yīng)用的合理性，需在制訂治療方案前準(zhǔn)確判斷致病菌，并進(jìn)行針對(duì)性給藥，可以縮短治療時(shí)間，改善患者癥狀及疾病預(yù)后效果[9]。

常規(guī)細(xì)菌鑒定法為鑒定志賀菌及沙門菌的常用方法，檢測(cè)環(huán)節(jié)包括3項(xiàng)，首先接種培養(yǎng)菌株，再行生化鑒定，最后對(duì)血清學(xué)予以檢測(cè)，檢測(cè)操作較為繁瑣及檢測(cè)試劑使用較多，因此檢測(cè)用時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，檢測(cè)人員必須具有較高的檢測(cè)技術(shù)及操作水平[10]。除此之外，常規(guī)細(xì)菌鑒定法的靈敏度不高，若受到以下因素影響，可能會(huì)降低檢測(cè)的準(zhǔn)確性：①因?yàn)樵摲椒ň哂蟹爆崗?fù)雜的流程，在操作過(guò)程中若取菌環(huán)未降溫，沾取的標(biāo)本無(wú)較多菌落數(shù)量[11]；對(duì)志賀菌或沙門菌無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確辨別，都有可能造成檢測(cè)結(jié)果誤差，提高漏診及誤診發(fā)生率[12]。②若在實(shí)施檢測(cè)之前，患者應(yīng)用廣譜抗菌類藥物，那么則會(huì)使檢測(cè)靈敏度降低。③若有干擾物質(zhì)或雜菌存在于被檢測(cè)樣品中，則有可能降低檢測(cè)成功率。除此之外，檢測(cè)時(shí)間、樣本數(shù)量以及培養(yǎng)條件等客觀因素都會(huì)對(duì)細(xì)菌鑒定結(jié)果造成影響，再加上檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，致使該方法的應(yīng)用效果較差。醫(yī)療技術(shù)及社會(huì)的不斷進(jìn)步使得分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療事業(yè)中，作為此類技術(shù)中用于鑒別腸道致病菌的方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法可以彌補(bǔ)常規(guī)細(xì)菌鑒定法的缺陷，因?yàn)樵摲椒z測(cè)的主要內(nèi)容為細(xì)菌DNA，除可用于鑒別致病菌外，還能夠?qū)?xì)菌性腹瀉予以追蹤。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法雖然具有較高的靈敏度及檢出率，但是需使用較為昂貴的試劑盒及離心管，為節(jié)約成本，可將上機(jī)樣品設(shè)置為20人份，用于平攤檢測(cè)費(fèi)用，并且不會(huì)影響鑒定結(jié)果。

本次研究結(jié)果顯示，360份糞便標(biāo)本中，常規(guī)細(xì)菌鑒定法檢測(cè)出沙門菌14株，志賀菌6株，檢測(cè)陽(yáng)性率分別為3.89%及1.67%；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)出沙門菌15株，志賀菌6株，檢測(cè)陽(yáng)性率分別為4.17%及1.67%。兩種檢測(cè)方法對(duì)沙門菌及志賀菌的檢測(cè)陽(yáng)性率比較，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。將實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)陽(yáng)性患者的糞便標(biāo)本再行常規(guī)細(xì)菌鑒定法檢測(cè)，陽(yáng)性率為100.00%。

綜上所述，在腸道致病菌的檢測(cè)中，可應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，該方法能夠在提高檢出率的同時(shí)，縮短檢測(cè)時(shí)間。