孫良旭 彭利軍 郭安兵 張艷青 魯 臨 吉布席

1.山東第一醫(yī)科大學研究生部 山東省醫(yī)學科學院，山東濟南 250062；2.山東省臨沂市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，山東臨沂 276000

胃癌是源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，胃癌的發(fā)病率、死亡率均位于世界癌癥發(fā)病率和死亡率前列[1]。東亞地區(qū)尤以我國更是胃癌高發(fā)地區(qū)[2-3]，其早發(fā)現(xiàn)、早診斷具有重要意義[4]。近年來關(guān)于DNA 甲基化在胃癌發(fā)病與預警方面的研究成為熱點[5-8]。Asada 等[9-10]研究顯示，胃組織EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平與異時性胃癌發(fā)生風險相關(guān)，但這些基因與胃癌癌前疾病的臨床及病理特征之間的關(guān)系尚未充分研究。本研究旨在通過對胃癌及其癌前疾病組織行EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平檢測，探究其基因甲基化與慢性胃炎萎縮、腸化、癌變等內(nèi)鏡及病理特征的相關(guān)性，進一步探討DNA 甲基化在胃癌早診早治中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年6 月—2020 年2 月于山東省臨沂市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）內(nèi)鏡中心行胃鏡及病理檢查的192 例患者作為研究對象。納入標準：①經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準；②患者許可并簽署知情同意書；③符合慢性胃炎、胃癌診斷標準[3,11]。排除標準：①合并其他良、惡性腫瘤及嚴重基礎(chǔ)疾??；②曾行胃部切除手術(shù)；③使用對研究造成影響的藥物，如甲基化抑制劑等。

依據(jù)胃癌的發(fā)展模式（Correa 級聯(lián)），將患者分為慢性非萎縮性胃炎組（95 例）、慢性萎縮性胃炎組（86 例）和胃癌組（11 例）；其中慢性非萎縮性胃炎組男61 例，女34 例；年齡27～81 歲，平均（57±11）歲。慢性萎縮性胃炎組男63 例，女23 例；年齡29～83 歲，平均（61±10）歲。胃癌組男7 例，女4 例；年齡37～87 歲，平均（64±14）歲。三組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 疾病診斷標準

慢性胃炎：符合《中國慢性胃炎共識意見》（2017 年，上海）[11]。胃癌：符合《胃癌診療規(guī)范》（2018 年版）[3]。萎縮、腸化：符合《慢性胃炎及上皮性腫瘤胃黏膜活檢病理診斷共識》[12]。

依據(jù)慢性胃炎不同萎縮程度（病理）分為低萎縮組（無、輕度，104 例）、高萎縮組（中、重度，77 例）；依據(jù)慢性萎縮性胃炎腸化程度分為低度腸化組（無、輕度，31 例）、高度腸化組（中、重度，55 例）；根據(jù)內(nèi)鏡下慢性萎縮性胃炎木村-竹本分類[13]分為低度萎縮組（C1，局限胃竇，24 例）、中度萎縮組（C2、C3，過胃竇、未達賁門，48 例）、高度萎縮組（O1、O2、O3，已達賁門，14 例）。

1.3 方法

1.3.1 標本收集與隊列完善 標本收集，胃鏡診療（電子胃鏡GIF-H260、H290，OLYMPUS）、病理診斷（10%福爾馬林固定）及甲基化測定（液氮、-80℃冰箱存放）規(guī)范進行。

1.3.2 基因甲基化測定 對胃組織EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因啟動子CPG 島區(qū)域相關(guān)位點（基因組位置國際編碼72920408～72920771、63178334～63178525、84496817～84497022）甲基化水平進行測定。通過多重PCR 技術(shù)擴增目的片段，結(jié)合二代測序平臺，對PCR產(chǎn)物進行測序，檢測目標區(qū)域甲基化狀態(tài)，計算不同位點甲基化水平（百分比）。實驗流程：DNA 提取[DNA提取試劑盒（Tiangen，上海松茸生物科技有限公司）]，重點在DNA 純度。亞硫酸鹽處理[重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒（DP215，凱杰生物有限公司）]。目標區(qū)域引物設(shè)計：EMX （上游：5’-GGAAATTCGTTGGGTATTGAAGG-3’、下游：5’-GACCTTCGAAATCCTAAACGATTC-3’）；miR-124a-3（上游：5’-GAAAGGGGAGAAGTGTGGG-3’、下游：5’-AAATCAAAATCCGCTATAAACACG-3’）；NKX6-1（上游：5’-GGGAAGTGAGTGTATTTGTATGTAC-3’，下游：5’-ACTCCACGATATCCCCAAATATAC-3’）。甲基化位點PCR 捕獲[多重PCR 擴增，特異性工作液對質(zhì)控品PCR 檢測，產(chǎn)物電泳檢測（3%瓊脂糖凝膠）]，樣本添加Index，上機測序（Illumina X-10 測序（Read1 測序、雜交Index 引物、Index 測序，Paired End Turnround、合成Read1 互補鏈，雜交Read2 引物、Read2 測序）等[PCR 儀（A-100、杭州朗基儀器公司），電泳儀（JY600+、北京君意東方電泳公司）。PCR 引物（PAGE 純化、上海百力格公司），dNTP（promega、上海有漁生物工程公司）]。由上海翼和應用生物技術(shù)有限公司支持。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，不符合正態(tài)分布的改用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25，P75）]表示表示，多組間比較用Kruskal-Wallis H 檢驗分析，兩組間比較用Mann-Whitney U 檢驗分析，有顯著性差異的兩兩比較用Bonferroni 法分析；計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組不同位點甲基化水平比較

三組EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因不同位點甲基化水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。慢性萎縮性胃炎組EMX1 基因（72920455、72920466、72920469）與miR-124a-3 基因（63178433、63178444、63178452）位點甲基化水平高于慢性非萎縮性胃炎組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。胃癌組NKX6-1 基因（84496988、84496933、84496882、84496840）位點甲基化水平低于慢性非萎縮性胃炎組及慢性萎縮性胃炎組；慢性萎縮性胃炎組NKX6-1基因（84496988、84496933、84496882、84496840）位點甲基化水平高于慢性非萎縮性胃炎組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

2.2 慢性胃炎不同萎縮程度（病理）組甲基化水平比較

高萎縮組EMX1 基因（72920466、72920469、7292 0484），miR-124a-3 基因（63178433、63178452、63178 485）與NKX6-1 基因（84497016、84496979、84496975）位點甲基化水平高于低萎縮組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表2。

2.3 慢性萎縮性胃炎不同腸化程度組甲基化水平比較

高度腸化組EMX1 基因（72920455、72920466、72920469），miR-124a-3 基因（63178334、63178377、63178433）與NKX6-1 基因（84497016、84496979、844 96975）位點甲基化水平高于低度腸化組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表3。

表1 慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組不同位點甲基化水平比較[M（P25，P75）]

表2 慢性胃炎不同萎縮程度（病理）組甲基化水平比較[M（P25，P75）]

表3 慢性萎縮性胃炎不同腸化程度組甲基化水平比較[M（P25，P75）]

2.4 慢性萎縮性胃炎不同萎縮程度（內(nèi)鏡）組甲基化水平比較

慢性萎縮性胃炎不同萎縮程度（內(nèi)鏡）組EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因不同位點甲基化水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。高度萎縮組EMX1 基因（72920581、72920627、72920639）位點甲基化水平高于低度萎縮組和中度萎縮組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。高度萎縮組miR-124a-3 基因（63178345、63178383、63178444）與NKX6-1 基因（84496965、84496893、84496884）位點甲基化水平高于低度萎縮組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表4。

3 討論

胃癌多數(shù)是在癌前變化基礎(chǔ)上發(fā)生，癌前變化分癌前疾病和癌前病變。目前對基因甲基化與胃癌狀態(tài)的研究較多[14-17]，近年已有關(guān)于應用DNA 甲基化預測胃部疾病進展[18-20]、胃癌風險分層的DNA 甲基化積累及標記的相關(guān)報道[21-22]，并且近期相關(guān)研究[23]顯示，血液中檢測DNA 甲基化可比常規(guī)診斷提前4 年發(fā)現(xiàn)癌癥（包括胃癌），但關(guān)于基因異常甲基化與胃癌癌前疾病的相關(guān)性仍需進一步探究。研究顯示[9-10]，胃組織EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平可預測異時性胃癌發(fā)生風險，但缺乏與臨床指標的關(guān)聯(lián)性研究，本研究將進一步探討這些基因甲基化在胃癌癌前疾病中的意義。

本研究結(jié)果顯示，胃組織在胃癌癌前變化的不同狀態(tài)中EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因的甲基化水平有明顯差異。慢性萎縮性胃炎甲基化水平明顯高于慢性非萎縮性胃炎（P ＜0.05）；而無論是在慢性胃炎（病理分級）不同萎縮程度、慢性萎縮性胃炎（內(nèi)鏡分級）不同萎縮程度，還是在慢性萎縮性胃炎不同腸化程度的甲基化水平差異比較中，均表現(xiàn)為病情越嚴重狀態(tài)的甲基化水平越高。提示胃癌癌前疾病在EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因上存在甲基化水平積累現(xiàn)象，即“慢性非萎縮性炎癥→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→胃癌”[24]演變過程中，胃癌癌前疾病相關(guān)病情越重，甲基化水平越高，提示EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化可能在胃癌癌前疾病萎縮及腸化的進展過程中發(fā)揮重要作用，值得進一步研究。而在胃癌組織中EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平未見明顯升高，NKX6-1 基因甲基化水平甚至低于慢性非萎縮性胃炎與慢性萎縮性胃炎，提示癌癥組織中甲基化水平有下降的趨勢。研究顯示[25]，NKX6-1 基因的甲基化可作為結(jié)直腸癌患者化療效果的預測因子。

表4 慢性萎縮性胃炎不同萎縮程度（內(nèi)鏡）組甲基化水平比較[M（P25，P75）]

本研究主要以研究胃癌癌前疾病為主，胃癌標本量相對不足，有一定局限性，其關(guān)于胃癌組織中甲基化水平有下降趨勢的結(jié)果是否有代表性尚需進一步探究，目前缺乏深入的機制性研究。

綜上所述，EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 三個基因甲基化可能在胃癌癌前疾病萎縮及腸化的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但其具體機制仍有待進一步深入探究。