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        EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 甲基化與胃癌癌前疾病的關(guān)系

        2021-03-28 12:40:48孫良旭彭利軍郭安兵張艷青吉布席
        中國醫(yī)藥導報 2021年5期
        關(guān)鍵詞:胃癌水平

        孫良旭 彭利軍 郭安兵 張艷青 魯 臨 吉布席

        1.山東第一醫(yī)科大學研究生部 山東省醫(yī)學科學院,山東濟南 250062;2.山東省臨沂市人民醫(yī)院消化內(nèi)科,山東臨沂 276000

        胃癌是源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤,胃癌的發(fā)病率、死亡率均位于世界癌癥發(fā)病率和死亡率前列[1]。東亞地區(qū)尤以我國更是胃癌高發(fā)地區(qū)[2-3],其早發(fā)現(xiàn)、早診斷具有重要意義[4]。近年來關(guān)于DNA 甲基化在胃癌發(fā)病與預警方面的研究成為熱點[5-8]。Asada 等[9-10]研究顯示,胃組織EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平與異時性胃癌發(fā)生風險相關(guān),但這些基因與胃癌癌前疾病的臨床及病理特征之間的關(guān)系尚未充分研究。本研究旨在通過對胃癌及其癌前疾病組織行EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平檢測,探究其基因甲基化與慢性胃炎萎縮、腸化、癌變等內(nèi)鏡及病理特征的相關(guān)性,進一步探討DNA 甲基化在胃癌早診早治中的作用。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取2015 年6 月—2020 年2 月于山東省臨沂市人民醫(yī)院(以下簡稱“我院”)內(nèi)鏡中心行胃鏡及病理檢查的192 例患者作為研究對象。納入標準:①經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準;②患者許可并簽署知情同意書;③符合慢性胃炎、胃癌診斷標準[3,11]。排除標準:①合并其他良、惡性腫瘤及嚴重基礎(chǔ)疾??;②曾行胃部切除手術(shù);③使用對研究造成影響的藥物,如甲基化抑制劑等。

        依據(jù)胃癌的發(fā)展模式(Correa 級聯(lián)),將患者分為慢性非萎縮性胃炎組(95 例)、慢性萎縮性胃炎組(86 例)和胃癌組(11 例);其中慢性非萎縮性胃炎組男61 例,女34 例;年齡27~81 歲,平均(57±11)歲。慢性萎縮性胃炎組男63 例,女23 例;年齡29~83 歲,平均(61±10)歲。胃癌組男7 例,女4 例;年齡37~87 歲,平均(64±14)歲。三組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05),具有可比性。

        1.2 疾病診斷標準

        慢性胃炎:符合《中國慢性胃炎共識意見》(2017 年,上海)[11]。胃癌:符合《胃癌診療規(guī)范》(2018 年版)[3]。萎縮、腸化:符合《慢性胃炎及上皮性腫瘤胃黏膜活檢病理診斷共識》[12]。

        依據(jù)慢性胃炎不同萎縮程度(病理)分為低萎縮組(無、輕度,104 例)、高萎縮組(中、重度,77 例);依據(jù)慢性萎縮性胃炎腸化程度分為低度腸化組(無、輕度,31 例)、高度腸化組(中、重度,55 例);根據(jù)內(nèi)鏡下慢性萎縮性胃炎木村-竹本分類[13]分為低度萎縮組(C1,局限胃竇,24 例)、中度萎縮組(C2、C3,過胃竇、未達賁門,48 例)、高度萎縮組(O1、O2、O3,已達賁門,14 例)。

        1.3 方法

        1.3.1 標本收集與隊列完善 標本收集,胃鏡診療(電子胃鏡GIF-H260、H290,OLYMPUS)、病理診斷(10%福爾馬林固定)及甲基化測定(液氮、-80℃冰箱存放)規(guī)范進行。

        1.3.2 基因甲基化測定 對胃組織EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因啟動子CPG 島區(qū)域相關(guān)位點(基因組位置國際編碼72920408~72920771、63178334~63178525、84496817~84497022)甲基化水平進行測定。通過多重PCR 技術(shù)擴增目的片段,結(jié)合二代測序平臺,對PCR產(chǎn)物進行測序,檢測目標區(qū)域甲基化狀態(tài),計算不同位點甲基化水平(百分比)。實驗流程:DNA 提取[DNA提取試劑盒(Tiangen,上海松茸生物科技有限公司)],重點在DNA 純度。亞硫酸鹽處理[重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(DP215,凱杰生物有限公司)]。目標區(qū)域引物設(shè)計:EMX (上游:5’-GGAAATTCGTTGGGTATTGAAGG-3’、下游:5’-GACCTTCGAAATCCTAAACGATTC-3’);miR-124a-3(上游:5’-GAAAGGGGAGAAGTGTGGG-3’、下游:5’-AAATCAAAATCCGCTATAAACACG-3’);NKX6-1(上游:5’-GGGAAGTGAGTGTATTTGTATGTAC-3’,下游:5’-ACTCCACGATATCCCCAAATATAC-3’)。甲基化位點PCR 捕獲[多重PCR 擴增,特異性工作液對質(zhì)控品PCR 檢測,產(chǎn)物電泳檢測(3%瓊脂糖凝膠)],樣本添加Index,上機測序(Illumina X-10 測序(Read1 測序、雜交Index 引物、Index 測序,Paired End Turnround、合成Read1 互補鏈,雜交Read2 引物、Read2 測序)等[PCR 儀(A-100、杭州朗基儀器公司),電泳儀(JY600+、北京君意東方電泳公司)。PCR 引物(PAGE 純化、上海百力格公司),dNTP(promega、上海有漁生物工程公司)]。由上海翼和應用生物技術(shù)有限公司支持。

        1.4 統(tǒng)計學方法

        采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,不符合正態(tài)分布的改用中位數(shù)(M)[四分位數(shù)(P25,P75)]表示表示,多組間比較用Kruskal-Wallis H 檢驗分析,兩組間比較用Mann-Whitney U 檢驗分析,有顯著性差異的兩兩比較用Bonferroni 法分析;計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。以P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組不同位點甲基化水平比較

        三組EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因不同位點甲基化水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P <0.05)。慢性萎縮性胃炎組EMX1 基因(72920455、72920466、72920469)與miR-124a-3 基因(63178433、63178444、63178452)位點甲基化水平高于慢性非萎縮性胃炎組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P <0.05)。胃癌組NKX6-1 基因(84496988、84496933、84496882、84496840)位點甲基化水平低于慢性非萎縮性胃炎組及慢性萎縮性胃炎組;慢性萎縮性胃炎組NKX6-1基因(84496988、84496933、84496882、84496840)位點甲基化水平高于慢性非萎縮性胃炎組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P <0.05)。見表1。

        2.2 慢性胃炎不同萎縮程度(病理)組甲基化水平比較

        高萎縮組EMX1 基因(72920466、72920469、7292 0484),miR-124a-3 基因(63178433、63178452、63178 485)與NKX6-1 基因(84497016、84496979、84496975)位點甲基化水平高于低萎縮組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P <0.05)。見表2。

        2.3 慢性萎縮性胃炎不同腸化程度組甲基化水平比較

        高度腸化組EMX1 基因(72920455、72920466、72920469),miR-124a-3 基因(63178334、63178377、63178433)與NKX6-1 基因(84497016、84496979、844 96975)位點甲基化水平高于低度腸化組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P <0.05)。見表3。

        表1 慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組不同位點甲基化水平比較[M(P25,P75)]

        表2 慢性胃炎不同萎縮程度(病理)組甲基化水平比較[M(P25,P75)]

        表3 慢性萎縮性胃炎不同腸化程度組甲基化水平比較[M(P25,P75)]

        2.4 慢性萎縮性胃炎不同萎縮程度(內(nèi)鏡)組甲基化水平比較

        慢性萎縮性胃炎不同萎縮程度(內(nèi)鏡)組EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因不同位點甲基化水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P <0.05)。高度萎縮組EMX1 基因(72920581、72920627、72920639)位點甲基化水平高于低度萎縮組和中度萎縮組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P <0.05)。高度萎縮組miR-124a-3 基因(63178345、63178383、63178444)與NKX6-1 基因(84496965、84496893、84496884)位點甲基化水平高于低度萎縮組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P <0.05)。見表4。

        3 討論

        胃癌多數(shù)是在癌前變化基礎(chǔ)上發(fā)生,癌前變化分癌前疾病和癌前病變。目前對基因甲基化與胃癌狀態(tài)的研究較多[14-17],近年已有關(guān)于應用DNA 甲基化預測胃部疾病進展[18-20]、胃癌風險分層的DNA 甲基化積累及標記的相關(guān)報道[21-22],并且近期相關(guān)研究[23]顯示,血液中檢測DNA 甲基化可比常規(guī)診斷提前4 年發(fā)現(xiàn)癌癥(包括胃癌),但關(guān)于基因異常甲基化與胃癌癌前疾病的相關(guān)性仍需進一步探究。研究顯示[9-10],胃組織EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平可預測異時性胃癌發(fā)生風險,但缺乏與臨床指標的關(guān)聯(lián)性研究,本研究將進一步探討這些基因甲基化在胃癌癌前疾病中的意義。

        本研究結(jié)果顯示,胃組織在胃癌癌前變化的不同狀態(tài)中EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因的甲基化水平有明顯差異。慢性萎縮性胃炎甲基化水平明顯高于慢性非萎縮性胃炎(P <0.05);而無論是在慢性胃炎(病理分級)不同萎縮程度、慢性萎縮性胃炎(內(nèi)鏡分級)不同萎縮程度,還是在慢性萎縮性胃炎不同腸化程度的甲基化水平差異比較中,均表現(xiàn)為病情越嚴重狀態(tài)的甲基化水平越高。提示胃癌癌前疾病在EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因上存在甲基化水平積累現(xiàn)象,即“慢性非萎縮性炎癥→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→胃癌”[24]演變過程中,胃癌癌前疾病相關(guān)病情越重,甲基化水平越高,提示EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化可能在胃癌癌前疾病萎縮及腸化的進展過程中發(fā)揮重要作用,值得進一步研究。而在胃癌組織中EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平未見明顯升高,NKX6-1 基因甲基化水平甚至低于慢性非萎縮性胃炎與慢性萎縮性胃炎,提示癌癥組織中甲基化水平有下降的趨勢。研究顯示[25],NKX6-1 基因的甲基化可作為結(jié)直腸癌患者化療效果的預測因子。

        表4 慢性萎縮性胃炎不同萎縮程度(內(nèi)鏡)組甲基化水平比較[M(P25,P75)]

        本研究主要以研究胃癌癌前疾病為主,胃癌標本量相對不足,有一定局限性,其關(guān)于胃癌組織中甲基化水平有下降趨勢的結(jié)果是否有代表性尚需進一步探究,目前缺乏深入的機制性研究。

        綜上所述,EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 三個基因甲基化可能在胃癌癌前疾病萎縮及腸化的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,但其具體機制仍有待進一步深入探究。

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