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        厄貝沙坦對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用及腎臟RAS 基因表達(dá)分析

        2021-03-28 12:40:48陳思思薛曉敏朱冰兒陳力豪吳人照
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:貝沙坦血壓劑量

        陳思思 薛曉敏 李 毓 朱冰兒 陳力豪 吳 悅 吳人照

        1.浙江省中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究所,浙江杭州 310007;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,浙江杭州 310053;3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,浙江杭州 310053

        全球高血壓患病率在逐年增加,專家預(yù)計(jì)到2025 年全球高血壓患者將上升達(dá)15 億人[1]。最新研究顯示中國成年人高血壓患病率已達(dá)27.9%[2],是我國心腦血管疾病的首要危險(xiǎn)因素。高血壓可導(dǎo)致如心肌梗死和腦卒中等致命性心腦血管疾病[3]。據(jù)《中國心血管病報(bào)告》統(tǒng)計(jì)報(bào)道[4],2016 年我國因心血管病死亡例數(shù)占比達(dá)40%以上,死亡率高于腫瘤及其他疾病,嚴(yán)重危害國民健康。針對高血壓治療的藥物一直是臨床關(guān)注的重點(diǎn),目前血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑 (ACEI)、β-受體阻滯劑被JNC8等指南推薦為高血壓的首選用藥[5]。ARB 類藥物主要通過阻斷血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)與受體結(jié)合達(dá)到抗高血壓的作用,近年來其在臨床抗高血壓治療中應(yīng)用日益廣泛[6]。厄貝沙坦屬于ARB 類,在輕中度高血壓患者中,因其降壓效果優(yōu)于氯沙坦和纈沙坦[7],臨床應(yīng)用最廣泛。目前尚未了解厄貝沙坦對SHR 大鼠降壓相關(guān)的基因表達(dá)情況的影響,因此,本實(shí)驗(yàn)以SHR 大鼠為研究對象,觀察厄貝沙坦對SHR 大鼠的血壓作用及ACE2、血管緊張素Ⅱ受體-1(AT1R)和AT2R mRNA 表達(dá)的情況,旨在為深入了解高血壓降壓機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        34 周以上(老齡)SHR 大鼠,Wistar 大鼠,雌性,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證:SYXK(浙)2019-0010。實(shí)驗(yàn)過程遵循了單位和國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用的準(zhǔn)則,并經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

        1.2 主要儀器及試劑

        日本BP-98A 型無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測量儀;美國Thermofisher Nano Drop 2000 核酸蛋白定量儀;美國ABI Step One Plus 熒光定量PCR 儀;厄貝沙坦片購自賽諾菲制藥有限公司;Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(047A)、SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒,均購自寶生物工程(大連)有限公司。上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成引物。

        1.3 實(shí)驗(yàn)分組

        大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后測量血壓,將SHR 大鼠隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組,每組6 只,另設(shè)6 只Wistar 大鼠為正常對照組。厄貝沙坦臨床上人的常用劑量為150 mg/d,按正常人體重60 kg 計(jì)算,劑量為2.5 mg/(kg·d),以人用劑量的6 倍作為大鼠的給藥劑量,即15 mg/(kg·d)。厄貝沙坦組每天灌胃15 mg/kg厄貝沙坦,模型組和正常對照組灌胃等量飲用水,給藥8 周,每周測量1 次給藥3 h 及24 h 的血壓,觀察收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)的波動(dòng)變化。RT-qPCR檢測腎組織中ACE2、AT1R、AT2R 的表達(dá)情況。

        1.4 測量血壓

        將大鼠置恒溫水浴鍋上預(yù)熱,隨環(huán)境溫度的變化對加熱時(shí)間進(jìn)行調(diào)整,使大鼠尾部血流量充盈便于血壓的測量。連通BP-98A 型無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測量儀,并通過配套軟件讀取數(shù)據(jù)。每只大鼠在清醒安靜狀態(tài)下測量6~10 次血壓,其均值為測量所得值。

        1.5 相關(guān)基因的表達(dá)情況

        取腎臟組織100 mg,徹底勻漿后用Trizol 試劑提取總RNA 并測定濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA,再采用SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒檢測腎臟ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的表達(dá)量。其中PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括SYBG 10 μL,H2O 6 μL,Primer F 0.8 μL,Primer R 0.8 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,模板DNA 2 μL。反應(yīng)條件為:95℃30 s;95℃、5 s,60℃、30 s,共40 個(gè)循環(huán);95℃、15 s,60℃、60 s,95℃、15 s 熔解曲線?;虻囊镄蛄芯唧w見表1。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        運(yùn)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用重復(fù)測量方差分析,進(jìn)一步兩兩比較,采用LSD-t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 厄貝沙坦不同給藥時(shí)間點(diǎn)對SHR 大鼠SBP 的影響

        厄貝沙坦組與模型組大鼠SBP 在給藥后3 h 和24 h 中,時(shí)間及交互作用比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),而組間比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2023.083、864.881,P <0.01)。厄貝沙坦組SBP 首次給藥,第2、4、6、8 周給藥后3 h 及24 h 低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05 或P <0.01)。厄貝沙坦組SBP 在給藥后3 h 均有顯著下降,在給藥后24 h 有所回升,但仍低于治療前SBP。見表2。

        表1 各基因引物序列

        2.2 厄貝沙坦不同給藥時(shí)間點(diǎn)對SHR 大鼠DBP 的影響

        厄貝沙坦組與模型組DBP 在給藥后3 h 和24 h時(shí),時(shí)間及交互作用比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),而組間比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=691.944、449.783,P <0.01)。厄貝沙坦組DBP 首次給藥后3 h低于模型組,第2、4、6、8 周給藥后3 h 及24 h 低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05 或P <0.01)。見表3。

        2.3 厄貝沙坦對SHR 大鼠腎臟中各基因相對表達(dá)量的影響

        與模型組比較,厄貝沙坦組ACE2 mRNA 相對表達(dá)量降低,AT2R mRNA 相對表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。見表4。

        表2 厄貝沙坦片不同給藥時(shí)間點(diǎn)對SHR 大鼠SBP 的影響(mmHg,)

        表2 厄貝沙坦片不同給藥時(shí)間點(diǎn)對SHR 大鼠SBP 的影響(mmHg,)

        注:與模型組同期比較,*P <0.05,**P <0.01。SBP:收縮壓。1 mmHg=0.133 kPa

        表3 厄貝沙坦片不同給藥時(shí)間點(diǎn)對SHR 大鼠DBP 的影響(mmHg,)

        表3 厄貝沙坦片不同給藥時(shí)間點(diǎn)對SHR 大鼠DBP 的影響(mmHg,)

        注:與模型組同期比較,*P <0.05,**P <0.01。DBP:舒張壓。1 mmHg=0.133 kPa

        表4 腎臟中ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的相對表達(dá)量()

        表4 腎臟中ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的相對表達(dá)量()

        注:與模型組同期比較,*P <0.05。ACE2:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2;AT1R:血管緊張素Ⅱ受體-1;AT2R:血管緊張素Ⅱ受體-2

        3 討論

        在降壓藥物研發(fā)過程中,谷峰比是其療效評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。谷峰比越高提示在24 h 內(nèi)藥物降壓作用越穩(wěn)定,有助于減少對靶器官的損傷[8-9]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)給藥3 h 的谷峰比最高,其降壓療效最穩(wěn)定,故本研究選擇在給藥3 h 和24 h 這兩個(gè)時(shí)間段測量血壓,以評(píng)價(jià)厄貝沙坦的最大降壓療效。

        高血壓對機(jī)體的心腦腎等器官具有嚴(yán)重?fù)p害,其發(fā)生、發(fā)展過程中涉及多個(gè)系統(tǒng)的參與。研究顯示[10],腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是參與血壓調(diào)節(jié)的重要系統(tǒng)。Ang Ⅱ是RAS 的主要活性物質(zhì),主要發(fā)揮收縮血管等作用[11],主要作用于AT1R,小部分作用于AT2R[12],其中AT1R 具有強(qiáng)烈的血管收縮作用,而AT2R介導(dǎo)的生物學(xué)作用與AT1R 相反,主要為利鈉作用,降低Na+在近曲小管中重吸收,保持Na+負(fù)平衡,進(jìn)一步降低血壓[13]。厄貝沙坦通過拮抗AT1R 抑制Ang Ⅱ介導(dǎo)的血管收縮和醛固酮的釋放,從而產(chǎn)生降壓作用。AT1R 和AT2R 在血壓調(diào)節(jié)中存在功能性相互作用,AT1R 阻斷后Ang Ⅱ增加導(dǎo)致其對立的AT2R 的刺激升高作用,本研究結(jié)果中AT1R 表達(dá)降低,而AT2R升高,與文獻(xiàn)[14]報(bào)道結(jié)果一致。

        近年來,ACE2 基因作為RAS 系統(tǒng)的新成員被廣泛研究,在體內(nèi)的主要作用是將Ang Ⅱ轉(zhuǎn)化為Ang(1-7),后者在體內(nèi)能引起血管擴(kuò)張,產(chǎn)生降血壓的作用從而維持機(jī)體正常的血壓平衡[15-16]。ACE2 對最初高血壓形成起重要作用,多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[17-22]沙坦類或其他藥物可使高血壓大鼠腎臟和心肌組織的ACE2 mRNA和蛋白表達(dá)增加,且多呈現(xiàn)出劑量依賴趨勢。而本研究卻發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦治療后ACE2 表達(dá)降低,推測可能與文獻(xiàn)[23]所提出的通路有關(guān),厄貝沙坦選擇性與AT1R結(jié)合,此時(shí)循環(huán)中Ang Ⅱ反饋增加,Ang Ⅱ又可以通過激活信號(hào)分子ERK1/2 和p38 MAP 上調(diào)ACE 并下調(diào)ACE2 的表達(dá)。厄貝沙坦使機(jī)體內(nèi)血壓降到低點(diǎn)后,機(jī)體產(chǎn)生血壓調(diào)節(jié)的保護(hù)作用,不再需要ACE2 協(xié)同來發(fā)揮降血壓作用,從而厄貝沙坦組的ACE2 表達(dá)降低。由于本研究樣本量偏小,而且只設(shè)置了一個(gè)給藥濃度,后期可考慮多個(gè)給藥劑量,深入研究厄貝沙坦的劑量不同是否對ACE2 表達(dá)有所差異。盡管目前ACE2 的信號(hào)通路已經(jīng)很好地建立,但Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ACE2 的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制仍然不太明確,后期需要進(jìn)一步研究。

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