盧蘭香，薛霞，魏莉莉，趙慧男，武傳香，丁一，公丕學，王駿，劉艷明，祝建華

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東省特殊醫(yī)學用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，山東濟南 250101）

特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品是指針對患有特殊紊亂、疾病或醫(yī)療狀況等特殊醫(yī)學狀況嬰兒的營養(yǎng)需求而設(shè)計制成的粉狀或液態(tài)配方食品[1]，是這些嬰兒生命早期或出生后相當長時間內(nèi)賴以生存的主要食物來源。常見特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品包括無乳糖或低乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解或氨基酸配方、早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方、母乳營養(yǎng)補充劑和氨基酸代謝障礙配方。

生物素（Biotin）又稱維生素H，屬于水溶性B族維生素。生物素的化學結(jié)構(gòu)是一個脲基環(huán)含有一個硫原子和一條戊酸的側(cè)鏈，可能有八種同分異構(gòu)體，天然存在的D-生物素具有活性[2]；生物素是參與機體蛋白質(zhì)、脂肪和糖類三大代謝的重要物質(zhì)[3]。食物中的生物素主要以游離形式或與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在，嬰幼兒缺乏生物素，會出現(xiàn)食欲不振、煩躁或嗜睡、濕疹、皮炎、發(fā)育遲緩等一系列癥狀[4]。食品安全國家標準GB 14880-2012[5]和GB 25596-2010[1]明確規(guī)定了特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素的添加形式和添加量，因此生物素也成為該類食品中的必檢項目。

目前，現(xiàn)有生物素的測定方法主要有微生物法[6]、酶聯(lián)免疫法[7]、熒光免疫層析法[8]、生物傳感器法[9]、毛細管電泳法[10]、液相色譜法[11-14]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]。其中，酶聯(lián)免疫法基于生物素和親和素的特定反應(yīng)，專一性強，但所用試劑價格昂貴，生物傳感器法重現(xiàn)性差；分光光度法靈敏度低；熒光法可靠性存在缺陷；生物素無典型的紫外和熒光發(fā)色團，液相色譜法采用紫外檢測器直接測定靈敏度比較低，不適合含量比較低的樣品，而熒光檢測器需要衍生過程比較繁瑣。微生物法也是食品安全國家標準GB 5009.259-2016[6]所采用的方法，靈敏度較高，但由于大多數(shù)菌株不是專一性的，因此會帶來較大的檢測誤差，且方法檢測周期長，僅接種和培養(yǎng)就需要19 h～20 h；操作復雜，需要在無菌條件下操作，對實驗環(huán)境要求苛刻；樣本間平行性不好；菌種保存困難等問題。特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品較普通嬰幼兒食品配方復雜、涉及的工藝類型較多，產(chǎn)品形態(tài)多樣，普通配方乳粉的檢測技術(shù)不適用于該類食品，而且特醫(yī)嬰配食品中生物素的檢測未見報道。

針對特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品配方復雜、形態(tài)多樣，所添加生物素含量低的特點，本研究擬以免疫親和柱進行凈化，同時結(jié)合超高效液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性對該類食品中的生物素進行測定，以期建立特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素的超高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法。為特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素的檢測提供技術(shù)參考，指導生產(chǎn)企業(yè)對產(chǎn)品的質(zhì)量控制，為政府監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-生物素（純度≥99.0%），德國Dr. Ehrenstorfer公司；生物素-d2（純度≥97.0%），上海ISOREAG 公司；生物素免疫親和柱（3 mL），德國拜發(fā)公司；甲醇、乙腈（色譜純），美國Fisher 公司；甲酸（色譜純），美國Sigma-Aldrich 公司；硫酸、磷酸、乙酸（優(yōu)級純），國藥集團化學試劑有限公司；二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、氫氧化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；有機微孔濾膜（0.22 μm），上海安譜科學儀器有限公司。

實驗用特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品（文中相關(guān)配方用字母代替）：無乳糖配方（A）、乳蛋白部分水解配方（B）、乳蛋白深度水解配方（C1）、氨基酸配方（C2）、早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方（D）、氨基酸代謝障礙配方（E）、母乳營養(yǎng)補充劑（F）均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYTM超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S 質(zhì)譜儀配備電噴霧（ESI）電離源和MasslynxTM色譜工作站，美國Waters 公司；Milli-Q 超純水制備器，美國Millipore 公司；超聲波清洗器，寧波新芝生物科技有限公司；MS3 渦旋混合器，IKA 公司；N-EVAP-45位氮吹儀，美國Organomation 公司；SQP-電子天平，塞多利斯科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

D-生物素標準儲備液（100 μg/mL）：準確稱取5 mg（精確至0.1 mg）生物素標準品于50 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1:1，V/V）定容至刻度，-18 ℃避光保存。

生物素-d2 標準儲備液（100 μg/mL）：準確稱取5 mg（精確至0.1 mg）生物素-d2 于50 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1:1，V/V）定容至刻度，-18 ℃避光保存。

將D-生物素標準儲備溶液用初始流動相逐級稀釋為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00、50.00 ng/mL（均含生物素-d2 內(nèi)標15 ng/mL）的系列標準工作液。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 提取

樣品混勻后稱取1 g（精確到0.001 g）至50 mL比色管中，加入750 ng 生物素-d2 內(nèi)標，加入25 mL的0.2 mol/L 磷酸溶液充分搖勻，在121 ℃下水解30 min，冷卻至室溫后，用1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至4.5±0.2 后，超聲約10 min。將試樣溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用水沖洗比色管，洗液合并于50 mL容量瓶中，用水定容至50 mL，經(jīng)濾紙過濾。

1.3.2.2 凈化

將生物素免疫親和柱連接到固相萃取裝置上，取1 mL 上述樣品提取溶液于50 mL 離心管中，加入10 mL 磷酸鹽緩沖溶液（0.15 mol/L pH 值7.0），混勻，調(diào)pH 值至7 左右，上樣，控制流速為2 mL/min，然后分別用20 mL 磷酸鹽緩沖溶液（0.15 mol/L pH 值7.0）和10 mL 水淋洗，抽干柱中液體，最后用2 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，45 ℃氮吹至干，用1 mL初始流動相復溶，經(jīng)0.22 μm 有機相濾膜過濾后上機。

1.3.3 色譜質(zhì)譜條件

1.3.3.1 色譜條件

Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；流動相：0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。梯度洗脫程序見表1 所示。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient program for mobile phase

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30 V；脫溶劑氣溫度450 ℃；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流速：850 L/h：錐孔反吹氣流速：150 L/h；碰撞氣流速：0.12 mL/min；生物素及內(nèi)標的定性離子定量離子對及質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 生物素的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The optimized MS parameters of biotin

1.4 基質(zhì)效應(yīng)評價

實驗通過在純?nèi)軇┡c樣品中添加同水平同位素內(nèi)標，測定二者的峰面積響應(yīng)值，評價基質(zhì)效應(yīng)[18]（Matrix effect）。

其中：MEF 為基質(zhì)效應(yīng)因子，A 為純?nèi)軇┲袃?nèi)標的峰面積響應(yīng)值，B 為樣品提取液中內(nèi)標的峰面積響應(yīng)值。

MEF 為0 表示無基質(zhì)效應(yīng)，絕對值越大基質(zhì)效應(yīng)越強，在-15%～15%之間，表示基質(zhì)效應(yīng)影響不明顯。

1.5 數(shù)據(jù)處理

通過與儀器配套的MasslynxTM色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集與處理，以及Origin 8.0 進行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的選擇

由于生物素的化學結(jié)構(gòu)中包括兩個五元雜環(huán)和一條戊酸的側(cè)鏈，所以實驗比較了Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.7 μm）和Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）兩種色譜柱的分離效果、峰面積響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，兩種色譜柱分離效果都比較好，但生物素在BEH C18 色譜柱上峰面積響應(yīng)值更好。所以實驗選擇BEH C18 色譜柱。

分別比較了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-10 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸）、乙腈-10 mmol/L 甲酸銨、甲醇-0.1%甲酸對目標物分離效果、靈敏度、峰形的影響。實驗表明，甲酸銨保留較弱，甲醇-0.1%甲酸響應(yīng)值低且分離效果不好，甲酸和甲酸銨（含0.1%甲酸）響應(yīng)值、分離和峰形無明顯差異。所以實驗選擇乙腈-0.1%甲酸為流動相。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 生物素及生物素-d2 標準溶液的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the biotin and biotin-d2

生物素采用電噴霧電離源正離子掃描模式，將濃度為100 ng/mL 的D-生物素和生物素-d2 標準溶液標準溶液，分別通過蠕動泵注入質(zhì)譜儀，調(diào)諧并優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)，最終確定D-生物素和生物素-d2 的定性定量離子對，具體質(zhì)譜參數(shù)見表2。在優(yōu)化的HPLC-MS/MS 條件下，生物素（10 ng/mL）及內(nèi)標（15 ng/mL）標準溶液的MRM 色譜圖見圖1。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取方式的優(yōu)化

圖2 不同提取方式對生物素提取的影響Fig.2 Effect on the extraction of biotin with different extractive methods

對于強化類食品中生物素多采用直接提取、酶解、酸水解方式提取。而特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品配方復雜、涉及的工藝類型較多，產(chǎn)品形態(tài)多樣；直接提取方式樣品難以過濾，所以實驗考察了酶解和酸水解兩種方式對生物素提取效果的影響（圖2）。實驗條件如下：

（1）樣品中加入45 ℃～50 ℃的水溶解混勻后，加入0.1 g 淀粉酶，在55 ℃下酶解30 min 后冷卻至室溫，調(diào)節(jié)試樣溶液的pH 值至1.7±0.1，放置約1 min后，調(diào)節(jié)pH 值至4.5±0.1；

（2）樣品用0.2 mol/L 磷酸溶解后在121 ℃下水解30 min，調(diào)節(jié)試樣溶液的pH 值至4.5±0.1；

實驗表明（圖2），兩種提取方式對于不同配方的特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素的提取效率影響不同，但酸水解均高于酶解。原因可能是食物品的生物素主要以游離形式或與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在，對于結(jié)合態(tài)的生物素酶解不能使生物素完全釋放，高溫酸水解才可以使生物素從蛋白質(zhì)復合物中釋放出來；不同配方的特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素的兩種存在形態(tài)比例不同，導致結(jié)果差異。所以實驗選擇用磷酸水解提取。

2.2.2 磷酸濃度的優(yōu)化

由于實驗擬采用免疫親和柱凈化，而用磷酸鹽緩沖溶液更適合于生物素在免疫親和柱上保留和凈化，所以實驗采用磷酸水解提取。由于磷酸濃度是影響生物素提取的重要因素之一，實驗分別考察了磷酸濃度為0.05、0.1、0.2、0.5 mol/L 對提取效率的影響（圖3）。結(jié)果表明，隨著磷酸濃度的增加，生物素的含量逐漸增加，超過0.2 mol/L 有所下降?？赡苁且驗榱姿釢舛容^低時不能使結(jié)合態(tài)生物素完全釋放出來，而磷酸濃度較高時會導致生物素部分降解，使結(jié)果偏低。因此，實驗選取磷酸濃度為0.2 mol/L。

圖3 磷酸濃度對生物素提取的影響Fig.3 Effect on the extraction of biotin with different phosphoric acid concentrations

2.2.3 沉淀方式的優(yōu)化

為防止蛋白質(zhì)等物質(zhì)對凈化過程產(chǎn)生干擾，實驗在磷酸水解后，考察了乙腈、亞鐵氰化鉀-乙酸鋅和調(diào)pH 值4.5 三種沉淀方式對生物素提取的影響（圖4）。

圖4 沉淀方式對生物素提取的影響Fig.4 Effect on the extraction of biotin with different precipitation methods

實驗表明，乙腈和亞鐵氰化鉀-乙酸鋅兩種沉淀方式沉淀效果良好，濾液澄清透明，但生物素含量均偏低；而調(diào)pH 值至4.5 后，除蛋白深度水解配方和氨基酸配方濾液出現(xiàn)輕微渾濁外，剩余其他配方特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品的濾液均為澄清透明溶液，沉淀效果良好。原因可能是因為乙腈在沉淀蛋白等物質(zhì)時同時沉淀了目標物，亞鐵氰化鉀-乙酸鋅是通過生成氰化亞鐵酸鋅絡(luò)合物與蛋白質(zhì)等物質(zhì)共沉淀，吸附或包裹了部分目標物。由于特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品配方的復雜性和工藝類型的多樣性，導致調(diào)pH 值至4.5后，蛋白深度水解配方和氨基酸配方仍顯輕微渾濁，但不影響樣品的凈化過程，所以實驗選擇調(diào)pH 值至4.5 沉淀蛋白等物質(zhì)。

2.2.4 固相萃取柱的選擇

特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品配方及其多樣復雜，樣品中含有的碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)、麥芽糊精等共提取物均會干擾生物素的測定，影響分析的準確性。所以實驗考察了可以有效去除樣品中鹽、磷脂和脂肪的新型的固相萃取柱Prime HLB 和高特異性的免疫親和柱凈化，對生物素基質(zhì)效應(yīng)的影響。

圖5 不同固相萃取柱對生物素基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.5 Effect of different elution volumes on the matrix effect of biotin

結(jié)果表明：特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品配方經(jīng)免疫親和柱凈化后基質(zhì)效應(yīng)明顯小于Prime HLB。樣品經(jīng)Prime HLB 凈化后，無乳糖配方基質(zhì)效應(yīng)絕對值小于15%，基質(zhì)效應(yīng)影響較小；其它配方均大于15%，會存在嚴重的基質(zhì)效應(yīng)。由于特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品種類繁多、復雜，難以凈化，從而干擾生物素的測定；而免疫親和柱是基于抗原和抗體反應(yīng)，除去沒有被結(jié)合的其他無關(guān)物質(zhì)，專一性強，凈化效果良好，基質(zhì)效應(yīng)的影響不明顯。因此，根據(jù)特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品的基質(zhì)特點，實驗選擇免疫親和柱凈化。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限

將1.3.1 步驟配制的標準系列工作液按濃度由低到高的順序依次經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行分析測定，以D-生物素標準工作溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，以D-生物素定量離子標準溶液響應(yīng)峰面積與內(nèi)標生物素-d2 定量離子溶液響應(yīng)峰面積之比和生物素-d2 質(zhì)量濃度的乘積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。在0.50～50.00 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為 Y=0.917333 X +0.43483，其線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9986。按1.3.2 前處理方法處理后，測試其信噪比，以信噪比S/N≥3 得到生物素的檢出限（LOD）為0.75 μg/100 g，以信噪比S/N≥10 得到生物素的定量限（LOQ）為2.50 μg/100 g，適合特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素定性定量分析。

表3 特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品生物素的含量及精密度Table 3 The content and precision of biotin in infant formulas for special medical purposes

表4 方法的回收率和精密度Table 4 Recovery and RSD for the method (n=6)

表5 本方法與GB 5009.259-2016 方法在特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素含量的分析結(jié)果比較Table 5 Comparison of results of biotin obtained by GB 5009.259-2016 and the method in this paper in infant formulas for special medical purposes

2.3.2 精密度

特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品：無乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方、早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方、氨基酸代謝障礙配方、母乳營養(yǎng)補充劑分別平行取樣6 組，按1.3.2 前處理方法處理，進行測定。樣品中生物素含量及精密度見表3。結(jié)果顯示，精密度小于4.77%，實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定。

2.3.3 回收率

選取深度水解配方奶粉（C1）為代表進行特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品回收率試驗，分別添加5.00 μg/100 g、10.00 μg/100 g、20.00 μg/100 g，3 個不同質(zhì)量濃度的標準溶液進行回收率實驗，各個水平平行測定6 次（表4）。由表4 可知，加標回收率在97.27%～102.06%之間，相對標準偏差在3.16%～5.64%之間。深度水解配方奶粉為特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中最復雜的基質(zhì)，說明該方法對特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中不同濃度生物素的測定具有較高的準確度。

2.3.4 基質(zhì)效應(yīng)評價

同位素稀釋質(zhì)譜內(nèi)標法是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)中消除基質(zhì)干擾、提高定量準確度最有效的方法[19,20]，因此本方法采用同位素稀釋質(zhì)譜法來校正前處理、檢測中目標物的損失與干擾，同時采用高特異性的免疫親和柱對樣品進行凈化，以最大限度地去除基質(zhì)干擾成分。研究表明，本方法基質(zhì)效應(yīng)均在-15%～15%之間，基質(zhì)效應(yīng)不明顯。

2.3.5 實際樣品的測定

應(yīng)用本方法和食品安全國家標準方法 GB 5009.259-2016 對市售不同品牌的特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品：無乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方、早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方、氨基酸代謝障礙配方、母乳營養(yǎng)補充劑進行分析，比較兩種方法之間的差異來驗證所建立方法的準確性（表5）。結(jié)果表明，兩種方法測定結(jié)果無明顯差異，因此實驗建立的方法可以用于特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素的檢測。

根據(jù)《GB 25596-2010 特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品通則》及《特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品通則》（GB 25596-2010）問答中生物素含量的參照范圍為0.4 μg/100 kJ～2.4 μg/100 kJ，其中乳蛋白深度水解配方或氨基酸配方可調(diào)整范圍為0.4 μg/100 kJ～5 μg/100 kJ，早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方和母乳營養(yǎng)補充劑（均適合于早產(chǎn)/低體重出生兒）可調(diào)整范圍為≤8.8 μg/100 kJ。由表5 可知，所購特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素含量均符合國家標準要求。

3 結(jié)論

3.1 實驗針對特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品配方復雜、形態(tài)多樣，采用免疫親和柱進行凈化，有效降低了基質(zhì)干擾成分的影響；采用同位素內(nèi)標法定量，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響和校正前處理過程損失帶來的偏差，提高了分析方法的準確性及穩(wěn)定性。

3.2 本方法采用酸水解提取生物素和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行測定，有效縮短了檢測周期，提高了分析效率。與國標所采用的微生物方法相比測定結(jié)果無明顯差異，但操作簡單、檢驗周期短、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素的分析檢測?？梢詾樘厥忉t(yī)學用途嬰兒配方食品中生物素的測定提供科學依據(jù)，為產(chǎn)品質(zhì)量控制或監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。