王鳴秋，楊俊，常雨桐，張濤，劉麗娟

（1.湖北省食品質量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北武漢 430075）（2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

諾如病毒（Norovirus，NoV）屬于杯狀病毒科（Caliciviridae），為單股正鏈無包膜RNA 病毒，直徑約為27～40 nm，全長7.5～7.7 kb。諾如病毒是引起人類食源性急性胃腸炎的最重要的病原體之一，在全球范圍內廣泛分布，諾如病毒引起的食物中毒占食源性疾病暴發(fā)的50%以上，在非菌性胃腸炎暴發(fā)中占90%以上[1]。我國作為全球15 個腹瀉高負擔國家之一，腹瀉病例中有11.6%檢出諾如病毒[2]，且病例數(shù)量呈現(xiàn)出逐年增長的態(tài)勢[3]。

諾如病毒目前無法進行體外培養(yǎng)，根據(jù)基因組特征分類，可將其分為7 組，GI 和GII 是引起人類感染的兩個主要基因組。食品中諾如病毒的檢測方法主要基于分子生物學，其中實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法相對較靈敏、特異性高，應用廣泛。由于食品基質復雜，病毒載量低，加之PCR 檢測中操作人員隨機誤差、模板質量和試劑擴增效率等問題可能會造成結果的偏差，因此通常需要加入陽性質控樣品保證檢測結果的可靠性和準確性[4]。目前主要采用凍干病毒顆?；蚵懵兜腄NA/RNA 作為質控品[5,6]，但兩種方法均有其缺陷，由于諾如病毒無法進行體外培養(yǎng)，無法大量獲取凍干的陽性顆粒，且具有感染可能性；而裸露的DNA/RNA 作為質控品則無法監(jiān)測核酸提取過程，沒有蛋白保護也容易降解。裝甲RNA 技術[7]是將噬菌體衣殼蛋白自行包裝形成病毒粒子結構，將特定的病毒RNA 片段包裹到衣殼蛋白內，這樣制成的病毒樣顆粒（virus like particles，VLPs）既無生物危險性，又能和陽性病毒樣本一樣，監(jiān)控整個檢測過程，耐受RNase 的降解，易于保存和運輸。目前裝甲RNA 技術已成功應用于RNA 病毒核酸檢測標準樣品的研究，包括腸道病毒[8]、人體免疫缺陷病毒[9]、戊肝病毒[10]等。然而，適配多項檢測標準且同時含有GI和GII 兩種基因組的諾如病毒裝甲RNA 標準樣品制備研究鮮有報道。

本研究基于MS2 噬菌體裝甲RNA 技術，研制了內含GI、GII 型諾如病毒兩聯(lián)檢測靶標的病毒樣顆粒標準品，并開展均勻性、穩(wěn)定性和定值研究，可作為食品檢測、醫(yī)療衛(wèi)生等機構諾如病毒檢測的陽性質控品，符合GB 4789.42-2016、SN/T 4784-2017、SN/T 4055-2014 等檢測標準，為保障食品安全和控制公共衛(wèi)生事件的發(fā)生提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7500Fast 實時熒光定量PCR 儀，美國Life Technologies 公司；Qubit 熒光定量儀，美國Life Technologies 公司；HT7700 透射電子顯微鏡，日本日立公司；Gel DocTM XR+凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；AKTA 蛋白純化系統(tǒng)，美國GE 公司。

大腸桿菌BL21 為本實驗室保存；引物和探針由上海生工合成，序列信息見表1；Takara Premix Ex Taq；PrimeScript One Step RT-PCR kit，大連寶生物工程有限公司；Qubit? RNA BR Assay Kit，美國Life technologies 公司；RNAsimple 總RNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；High capacity cDNA reverse transcription kit，美國Thermo Fisher Scientific公司。

表1 諾如病毒RT-PCR 引物探針序列[11]Table 1 Primers and probes of RT-PCR for Norovirus

1.2 試驗方法

1.2.1 重組質粒構建

參考 GenBank 數(shù)據(jù)庫中的 MS2 噬菌體（NC_001417.2）基因組序列以及GB 4789.42-2016、SN/T 4784-2017 和SN/T 4055-2014 中規(guī)定的GI/GII型檢測靶標所對應的cDNA 序列，委托蘇州泓迅生物科技股份有限公司人工合成包含MS2 噬菌體成熟酶蛋白、衣殼蛋白、包裝位點和檢測靶標（GI、GII 串聯(lián)）的核酸片段，并克隆到pET-28a(+)載體中，構建重組質粒，命名為pET-MS2-NoV（見圖1）。用NotΙ單酶切和SacΙ/NotΙ 雙酶切鑒定陽性重組質粒，并進行測序驗證。

圖1 重組質粒pET-MS2-NoV 構建示意圖Fig.1 Schematic diagram of the construction of pET-MS2-NoV plasmid

1.2.2 病毒樣顆粒的誘導表達

將重組質粒pET-MS2-NoV 轉入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，取轉化產(chǎn)物50 μL 涂布于Kana 抗性（50 μg/mL）LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落到含有Kana 抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按1:100 比例將過夜培養(yǎng)菌液接入500 mL 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600 約為0.5，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）10 μmol/L 誘導培養(yǎng)12 h，離心5 min 收集菌體沉淀，加入PBS 緩沖液溶解，SDS-PAGE 分析蛋白表達情況。

1.2.3 病毒樣顆粒的純化

將1.2.2 收集的菌體沉淀加入PBS 緩沖液重懸，超聲破碎，10000 r/min 離心15 min 收取上清，按照0.25 g/mL 的比例加入NaCl 粉末，在加入等體積20%PEG6000，4 ℃放置過夜充分沉淀，11000 r/min 離心20 min 去上清，沉淀于PBS 中重懸，4 ℃放置5 h 后11000 r/min 離心20 min，收集上清為初步純化產(chǎn)物。純化后的上清加入高濃度DNaseI 和RNase，37 ℃反應4 h。降解產(chǎn)物通過丙烯葡聚糖凝膠（Sephacryl S-200 HR）柱層析進一步純化，柱壓0.15 MPa，流速0.5 mL/min，使用樣品自動收集器收集A280＞50 mmol/L范圍的樣品峰，并進行SDS-PAGE 電泳檢測鑒定。由此獲得純化后含GI-GII 諾如病毒兩聯(lián)裝甲RNA，命名為AR-NoV。

1.2.4 病毒樣顆粒的鑒定

1.2.4.1 電鏡觀察

將AR-NoV 稀釋到合適濃度，2%磷鎢酸負染，透射電鏡觀察病毒樣顆粒的形態(tài)，測量其直徑。

1.2.4.2 AR-NoV 中殘留質粒的檢測

RNAsimple RNA 試劑盒提取AR-NoV 中RNA，將其設置為兩組，一組進行反轉錄，另一組不進行反轉錄，之后兩組均以QNIF2、COG2R、QNIFs 為引物探針，同時進行熒光定量PCR 檢測，驗證是否含有殘留質粒DNA。反轉錄反應條件為：10×RT buffer 2.0 μL，25×dNTP Mix 0.8 μL，10×RT Random Primers 2.0 μL，Multiscribe reverse transcriptase 1.0 μL，RNase Inhibitor 1.0 μL，模板10 μL，補水至20 μL；25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min。熒光定量PCR 反應條件為：Premix taq 預混液12.5 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，探針（10 μM）0.5 μL，模板1 μL，補水至25 μL；95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s ，60 ℃ 30 s，收集熒光信號；40 個循環(huán)。

1.2.5 初步定值

1.2.5.1 標準曲線的建立

提取AR-NoV 中的RNA，用Qubit? RNA BR Assay Kit 測定RNA 濃度，參照公式：RNA 拷貝數(shù)/copies/μL=6.02×1023copies/mol×RNA 濃 度/ng/μL×10-9/（片段長度/bp×340）計算其對應的拷貝數(shù)。10 倍梯度稀釋提取的RNA，用表1 中引物與探針分別對兩種型別靶標進行一步法RT-PCR 檢測，每個樣品設置3 個平行。反應條件為：2×One step RT-PCR buffer III 10 μL，Takara Ex Taq HS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixII 0.4 μL，上下游引物（10 μM）各0.5 μL，探針（10 μM）0.25 μL，模板1 μL，補水至20 μL；42 ℃ 5 min； 95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，收集熒光信號；40 個循環(huán)。以拷貝數(shù)對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.5.2 定值及不確定度分析

根據(jù)初步計算的拷貝數(shù)將純化的AR-NoV用PBS稀釋到濃度約為107copies/μL，加入保護劑，每瓶300 μL，分裝到2 mL 西林瓶中進行真空冷凍干燥。隨機選取15 管，RNAsimple RNA 試劑盒提取RNA，按1.2.5.1 反應條件進行RT-PCR 分別測定兩個靶標的Ct值，根據(jù)標準曲線計算其拷貝數(shù)，計算平均值，得到諾如病毒GI/GII 型VLPs 初步定值結果。定值過程產(chǎn)生的不確定度分析參考JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[12]，采用A 類不確定度公式進行不確定度分析。

其中tα（m-1）表示顯著性水平α，自由度為m-1 的t 值；為單次測量的平均值；為測量的總平均值；m 為測量次數(shù)。

1.2.6 均勻性測定

參照GB/T 15000.3-2008[13]要求，隨機抽取26 瓶凍干AR-NoV，每瓶設置3 個子樣，共52 個子樣。按1.2.5 方法檢測2 個靶標的有無，并根據(jù)標準曲線計算拷貝數(shù)，采用SPSS 23.0 軟件單因素方差分析法檢驗樣本均勻性。

1.2.7 短期穩(wěn)定性測定

參照GB/T 15000.3-2008[13]要求，將凍干AR-NoV分別放置在37 ℃、25 ℃保存不同天數(shù)后置于-80 ℃保存，統(tǒng)一按1.2.5 方法測定，每個時間點設置3 個平行，采用SPSS 23.0 軟件單因素方差和線性回歸方法統(tǒng)計樣本的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pET-MS2-NoV 的構建

圖2 pET-MS2-NoV 的酶切鑒定電泳圖Fig.2 Enzyme digestion of pET-MS2-NoV

本研究中病毒樣顆粒的表達體系，是利用MS2噬菌體蛋白質和基因組RNA 相互作用的機制及噬菌體衣殼蛋白空間構象的特點構建的。MS2 噬菌體復制酶編碼基因5’端存在一個由19 個堿基組成的莖環(huán)結構（ACAUGAGGAUUACCCAUGU），該莖環(huán)結構實際上是個包裝位點，衣殼蛋白二聚體與其結合形成復合物后可啟動噬菌體自我包裝[14]。若將外源cDNA 序列融合至包裝位點后，經(jīng)轉錄翻譯即可將外源RNA包裝到衣殼蛋白內組裝成MS2 噬菌體樣顆粒，從而有效保護外源RNA 不被RNase 降解[7]。分別用Sac I/Not I 雙酶切和Not I 單酶切鑒定構建的重組質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小與預期一致，如圖2 所示，同時測序結果表明人工合成片段正確克隆到載體pET-28a(+)中，證實重組質粒構建成功，命名為pET-MS2-NoV。

2.2 pET-MS2-NoV 在原核細胞中的誘導表達

將重組質粒pET-MS2-NoV 轉入BL21 感受態(tài)細胞中，加入IPTG 誘導表達，噬菌體MS2 衣殼蛋白自主裝配形成病毒樣顆粒，并將諾如病毒RNA 片段包裝到粒子內部。經(jīng)SDS-PAGE 檢測，在10～15 ku 之間可觀察到一條明顯的重組蛋白表達條帶，如圖3 箭頭所示，大小與預期一致，表明MS2 噬菌體衣殼蛋白表達成功。

圖3 蛋白表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 結果Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression product

2.3 病毒樣顆粒的純化

在病毒樣顆粒純化過程中，我們發(fā)現(xiàn)原核表達蛋白中混有大量的質粒DNA 和雜蛋白，常規(guī)DNase 酶消化根本不能完全去除殘留質粒DNA。殘留的質粒DNA 不經(jīng)RNA 提取和反轉錄即可呈現(xiàn)陽性結果，失去了裝甲RNA 全過程監(jiān)測的優(yōu)勢，對標準樣品質量影響很大。PEG 沉淀和超速離心法是經(jīng)典的蛋白質/病毒純化方式，可有效去除雜蛋白和殘留核酸，在RNA 病毒標準品的制備研究中多有報道[15-18]，但PEG沉淀后會使終產(chǎn)物殘留大量化學試劑，而超速離心效率低僅適合小量制備[19]。Wang S[10]和劉瑩等[20]在戊肝病毒裝甲RNA 制備中使用超濾離心管可有效去除雜蛋白，時間短、操作簡單。而凝膠色譜是利用分子篩效應分離分子量大小不同的蛋白，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇孔徑合適的凝膠色譜柱，純化簡單易行、適合規(guī)?；僮鱗21]，在多篇文獻中均有報道[15-17]。在實際應用中往往會聯(lián)合使用以上兩種或多種不同的病毒樣顆粒的純化方法，相互彌補不足從而達到純化目的。本研究經(jīng)預實驗發(fā)現(xiàn)凝膠色譜的純化效果與超速離心相當，但如果將表達產(chǎn)物直接上柱可能會因雜蛋白過多而造成堵塞。因此最終采用PEG6000 沉淀大量雜蛋白，高濃度DNase 消化殘留DNA 和Sephacryl S-200 HR 凝膠過濾再次純化的組合方式。

圖4 Sephacryl S-200 HR 柱純化吸光度分析Fig.4 Absorbance of samples during purification by Sephacryl S-200 HR gel chromatography

2.2 中表達產(chǎn)物經(jīng)PEG6000、高濃度DNase 和RNase 處理初步純化后，再通過分子篩凝膠柱純化，圖4 顯示了目的產(chǎn)物峰出現(xiàn)在洗脫體積40 mL 左右，此時260 nm 和280 nm 吸光值均達到最大，說明此處靶標RNA 和蛋白外殼含量最高，因此收集該處洗脫液進行瓊脂糖凝膠電泳和SDS-PAGE 鑒定。圖5 顯示了純化后的表達產(chǎn)物，在10～15 ku 處有一明顯條帶，無雜帶干擾，說明病毒樣顆粒的純化效果較好，命名為AR-NoV。

圖5 VLPs 純化后SDS-PAGE 結果Fig.5 SDS-PAGE analysis of VLPs after purification

2.4 病毒樣顆粒的鑒定

2.4.1 電鏡形態(tài)鑒定

應用HT7700 透射電鏡，100 kV 加速電壓下觀察AR-NoV 形態(tài)，如圖6 所示可見大量結構完整，大小均一的球形顆粒，直徑為25 nm 左右，表明該蛋白已自組裝形成病毒樣顆粒，而且純化過程中沒有造成VLPs 結構破壞，仍保持天然狀態(tài)。

圖6 AR-NoV 電鏡圖Fig.6 The transmission electron microscopy of AR-NoV

2.4.2 AR-NoV 中殘留質粒的檢測

圖7 AR-NoV 殘留核酸熒光定量PCR 檢測結果Fig.7 Real-time PCR for residual DNA detection in the AR-NoV

以AR-NoV 提取的RNA 為模板，經(jīng)反轉錄或不經(jīng)反轉錄后同時進行熒光定量PCR，設置重組質粒為陽性對照，ddH2O 為空白對照，如圖7 所示，AR-NoV經(jīng)RT-PCR 后Ct 值為21.71，而直接進行熒光定量PCR的Ct 為35.63（可視為陰性），說明AR-NoV 中無質粒DNA 殘留。

2.5 AR-NoV 初步定值

將提取的RNA 用Qubit RNA BR Assay Kits 測定濃度為12.3 ng/μL，根據(jù)拷貝數(shù)計算公式，計算其拷貝數(shù)為2.19×1010copies/μL。10 倍梯度稀釋RNA，一步法RT-PCR 分別測定GI 型和GII 型各濃度模板Ct值，擴增曲線如圖8 所示。以RNA 各稀釋度拷貝數(shù)對數(shù)為橫坐標，以Ct 值為縱坐標繪制標準曲線。GI型NoV 標準曲線為y=-0.241x+12.036，R2=0.994；GII型NoV 標準曲線為y=-0.2333x+11.643，R2=0.999。

將隨機選取的15 管凍干AR-NoV 用PBS 稀釋后提取RNA，采用RT-qPCR 測定Ct 值，帶入上述標準曲線公式計算得到GI 和GII 型AR-NoV 的拷貝數(shù)分別為4.04×107copies/μL 和6.16×107copies/μL。采用A類不確定度公式計算得到GI和GII由定值過程引入的不確定度為0.62×107copies/μL 和0.30×107copies/μL，詳情見表2。因此本次制備的諾如病毒標準品AR-NoV中GI 型NoV 定值結果為(4.04±0.62)×107copies/μL，GII 型NoV 定值結果為(6.16±0.30)×107copies/μL。

圖8 AR-NoV 標準曲線制備RT-PCR 擴增圖Fig.8 Standard curve preparation RT-PCR of AR-NoV

表2 AR-NoV 中GI/GII 型靶標定值不確定度結果Table 2 Quantification uncertainty of AR-NoV for type GI/GII Norovirus

表3 均勻性檢測方差分析Table 3 Variance analysis of homogeneity test

表4 短期穩(wěn)定性結果分析Table 4 Trend test for short-term stability

2.6 均勻性檢驗

為考察特征量值的均勻性，隨機選取26 管凍干AR-NoV 提取RNA 后進行RT-PCR 檢測，根據(jù)2.5 得到的標準曲線定量AR-NoV 中GI/GII 元件拷貝數(shù)濃度，采用單因素方差分析法進行均勻性檢驗（表3）。根據(jù)顯著性水平α=0.05 和自由度（25,52）可得臨界值F0.05(25,52)=1.72，統(tǒng)計結果表明GI 和GII 所得F 均小于F0.05(25,52)，組內與組間無明顯差異，本批標準樣品的拷貝數(shù)濃度量值在瓶間具有良好的均勻性。

2.7 短期穩(wěn)定性檢驗

短期穩(wěn)定性檢驗旨在考察標準樣品的運輸穩(wěn)定性，本研究選擇了37 ℃和25 ℃兩個運輸中可能出現(xiàn)的溫度點考察標準樣品拷貝數(shù)濃度短期穩(wěn)定性。采用RT-PCR 標準曲線定量37 ℃/25 ℃在不同時間點抽取樣品的拷貝數(shù)濃度，通過樣品拷貝數(shù)濃度隨時間變化情況，采用線性回歸模型Y=b0+b1X 進行趨勢分析（b0，b1為回歸系數(shù)，X 為保存時間，Y 為標準物質特征量值）。通過數(shù)據(jù)分析顯示，|b1|均小于t0.95,(n-2)×S(b1)，表明斜率不顯著，沒有觀察到不穩(wěn)定（表4）。因此，本研究制備的AR-NoV 標樣在37 ℃至少可穩(wěn)定保存15 d；25 ℃至少可穩(wěn)定保存24 d，結果見表4。與傳統(tǒng)方法制備的RNA 病毒標準品相比，如原霖等[22]研制的PRRSV 凍干病毒顆粒標準品25 ℃和37 ℃可穩(wěn)定7 d和1 d，劉志玲等[23]研制的病毒性出血性敗血癥病毒cDNA 標準物質室溫可穩(wěn)定7 d，該裝甲RNA 標樣短期穩(wěn)定性遠高于凍干病毒顆粒和cDNA，有效解決了RNA 質控品保存和運輸穩(wěn)定性問題。

3 結論

3.1 諾如病毒的傳播途徑主要為人與人之間的接觸傳播、食源性傳播和水源性傳播，不同基因型的諾如病毒的傳播途徑存在一定的差異[24]。GII 型諾如病毒是全球所有年齡段人群中大部分諾如病毒爆發(fā)的原因，而在食源性和水源性暴發(fā)中更常檢測到GI 型[25]。由于諾如病毒僅有一小段足夠保守的基因組序列可用來設計RT-PCR 檢測引物和探針[26]，大部分研究報道的檢測靶標均集中在ORF1-ORF2 連接區(qū)域[27,28]。本研究對現(xiàn)有食品中諾如病毒檢測標準中靶標序列進行梳理，將GI 和GII 型檢測靶標對應的cDNA 序列串聯(lián)合成，表達出同時含有GI 和GII 型靶標的兩聯(lián)裝甲RNA，可適用于GB 4789.42-2016、SN/T 4784-2017和、SN/T 4055-2014 三個檢測標準的陽性參考物質，同時兩聯(lián)裝甲RNA 能夠滿足多重檢測對陽性標準樣品的需求，減少質控樣品提取、加樣、擴增等步驟，提高檢測的時效性和經(jīng)濟性，與現(xiàn)有標準品相比具有一定優(yōu)勢。

3.2 從理論上講，MS2 衣殼蛋白的包裝長度應與其基因組大小3569 nt 相近，但研究人員通過改變包裝策略、增加或修飾包裝位點等方法大幅度提升了外源片段包裝長度。Zhan S 等[29]采用單質粒雙表達系統(tǒng)在大腸桿菌中成功包裝3024 nt 的HIV 病毒；Lin GG 等[15]通過增加pac 位點的數(shù)目和親和力構建了包含4942 nt的寨卡病毒裝甲RNA 表達系統(tǒng)；Zhang L 等[30]首次實現(xiàn)了MS2 噬菌體衣殼蛋白對雙鏈DNA 的包裝，包裝長度達到6.5 kb。包裝長度的增加意味著MS2 噬菌體可包容多種病毒或單種病毒多重靶標，使得標準樣品的制備更加經(jīng)濟、高效。另外，Yao L 等[25]通過對噬菌體MS2 和Qβ裝甲RNA 在-20 ℃、4 ℃、45 ℃三種保存條件下的對比試驗，發(fā)現(xiàn)由噬菌體Qβ制備的裝甲RNA 具有更高的穩(wěn)定性，為標準品提供了一條新的制備策略。

3.3 綜上所述，本研究制備的內含GI 和GII 型諾如病毒檢測靶標的兩聯(lián)裝甲RNA 純度高，拷貝數(shù)高，均勻性和穩(wěn)定性良好，可作為GB 4789.42-2016、SN/T 4784-2017 和、SN/T 4055-2014 三項檢測標準的陽性質控品，同時滿足多重檢測需求，實現(xiàn)了對諾如病毒檢測全過程質控，有望申報為國家標準樣品，并為其他病原體核酸標準樣品制備提供了思路。