王琰，曾新安，蔡錦林

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.中新國際聯(lián)合研究院，廣東廣州 510000）

低醇酒是釀制果酒的一種，由于其酒精度低，營養(yǎng)價值高越來越受到消費(fèi)者的歡迎。最早出現(xiàn)的低醇酒是低醇葡萄酒[1]，GB 15037-2006 中規(guī)定低醇葡萄酒是采用鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)全部或部分發(fā)酵，采用特種工藝加工而成的酒精度為1%～7%的葡萄酒。低醇菠蘿酒也采用此定義法。菠蘿，味甘、微酸，含有豐富的維生素，有解暑止渴，消食止瀉等功效。成熟菠蘿糖度一般在110～160 g/L[2]，是釀造低醇酒的合適原料。

目前低醇酒的釀造方法一般有脫醇法，特殊酵母發(fā)酵法，酶處理法，終止發(fā)酵法[3]，其中又以終止發(fā)酵法最為常用，一般包括熱處理，降溫，添加二氧化硫等。熱處理一般采用巴氏殺菌法，在75～90 ℃殺滅酵母菌[4]。脈沖電場滅菌技術(shù)處理時間短，殺菌效率高且熱效應(yīng)不明顯，將其應(yīng)用于果酒的低溫滅菌處理能更好的保存果香和營養(yǎng)成分[5]。酵母菌是單細(xì)胞真核微生物，對脈沖處理敏感，一般10 kV/cm 就能致死，且脈沖寬度也對其影響顯著[6]。影響脈沖電場殺菌的因素主要有電場強(qiáng)度、有效處理時間、脈沖波形等，有效處理時間取決于介質(zhì)接受的脈沖數(shù)與脈沖寬度[7]。目前對酵母菌的致死研究主要是果汁[8]和啤酒[9]類，對低醇酒的終止發(fā)酵效果研究很少。

本試驗選取熱滅菌、二氧化硫法以及脈沖電場滅菌終止發(fā)酵方式制備菠蘿低醇果酒，探討不同終止發(fā)酵方式對發(fā)酵過程中的酵母致死率以及菠蘿低醇酒酒精度、殘?zhí)?、總酸、揮發(fā)酸、干浸出物、總二氧化硫、色澤、香氣成分、感官分析的影響，選取一種對菠蘿低醇酒品質(zhì)影響最小的終止發(fā)酵方法，以期為低醇酒的生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海南東閣鎮(zhèn)新鮮金菠蘿；ELEGANCE 馬利酵母、Optivin RED 果膠酶、偏重亞硫酸鉀、檸檬酸（食品級）；乙醇為色譜級；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；甲基異丁基甲醇，色譜級。

1.2 儀器設(shè)備

高壓脈沖電場滅菌設(shè)備：EX-1900，廣州市心安食品科技有限公司；方波，二次處理滅菌；自動頂空進(jìn)樣器（7697A），美國安捷倫公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B-5975C），美國安捷倫公司；全自動色差儀（CR-400），日本美能達(dá)公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 菠蘿低醇酒制備要點(diǎn)

挑撿：選取成熟菠蘿，去除壞果、爛果，破碎榨汁，加入60 mg/L 二氧化硫和100 mg/L 果膠酶，取上層汁4 ℃?zhèn)溆茫?/p>

成分調(diào)整：調(diào)整菠蘿汁糖度至130～135 g/L，酸度（以酒石酸計）6.20 g/L；取適量果汁加入活性干酵母90 mg/L 于30～35 ℃水浴活化20 min 后使用，在20 ℃控溫發(fā)酵；

終止發(fā)酵：將發(fā)酵至（4.80±0.50）% vol 的菠蘿低醇酒在0 ℃ 4000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行不同終止發(fā)酵處理；

澄清：加入300 mg/L 皂土在4 ℃靜置5 d，取上清液膜過濾得到成品。

1.3.2 終止發(fā)酵條件的確定

1.3.2.1 脈沖電場終止發(fā)酵條件的確定

本實(shí)驗中脈沖設(shè)備波形為方波，處理室體積0.02 mL，處理頻率1000 Hz，菠蘿低醇酒流速5 mL/s。參照預(yù)實(shí)驗條件，探討在場強(qiáng)條件10.00 kV/cm、12.50 kV/cm、15.00 kV/cm，有效處理時間40、80、120 μs條件下，脈沖電場終止發(fā)酵的有效條件，組別SPEF。

1.3.2.2 熱處理條件的確定

本試驗參照預(yù)實(shí)驗條件，在75 ℃水浴恒溫?zé)崽幚?、10、15、20 min，確定不同條件下酵母菌的殘留量，從而確定熱滅菌法終止發(fā)酵的有效條件，組別ST。

1.3.2.3 二氧化硫處理條件的確定

本試驗參照預(yù)實(shí)驗條件，分別加入100、125、150 mg/L 二氧化硫，確定不同條件下酵母菌的殘留量，從而確定二氧化硫法終止發(fā)酵的有效條件，組別SSO2。

1.4 理化分析

根據(jù)GB 4789.2-2016方法測定樣品在終止發(fā)酵處理前后酵母菌落總數(shù)；根據(jù)GB 15038-2006 葡萄酒、果酒通用分析方法測定菠蘿低醇酒中總糖、總酸、揮發(fā)酸、干浸出物、總二氧化硫含量、感官分析；采用全自動色差儀，測定果酒色澤，以L*、a*、b*表征。采用頂空氣相色譜法（HS-GC）進(jìn)行酒精度分析。

HS 條件：加熱箱溫度：50 ℃；傳輸線溫度：80 ℃；樣品瓶平衡時間：15 min；恒定流量：50 mL/min，保持時間：0.25 min。

GC 條件：進(jìn)樣口溫度：230 ℃；檢測器溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持10 min，以10 ℃/min 升溫到210 ℃；分流比：10:1；空氣流量：400 mL/min；尾吹氣流量：25 mL/min；載氣N2流量：30 mL/min；色譜柱：HP-5 氣相色譜柱（30 m×25 mm×25 μm）。

樣品處理：準(zhǔn)確稱取0.30 g 氯化鈉，吸取1 mL待測酒樣加入頂空進(jìn)樣瓶，壓蓋備測。

1.5 HS-SPME-GC-MS 香氣分析

GC 條件：起始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升到120 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min 升至220 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口、檢測器溫度：250 ℃；載氣為高純氦氣，流速1.00 mL/min；分流比10:1。

MS 條件：EI 離子源；流速：1 mL/min；質(zhì)量范圍33～350m/z。

樣品處理：準(zhǔn)確吸取5 mL 酒樣，10 μL 內(nèi)標(biāo)（3.21 mg/L 甲基異丁基甲醇）稱取1.25 g 氯化鈉加入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋備測，自動頂空進(jìn)樣。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2019 軟件繪制圖表，SPSS 24.0 進(jìn)行相關(guān)性和顯著性分析，各項指標(biāo)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌效率

2.1.1 脈沖電場終止發(fā)酵法

圖1d 中可以明顯看出，酵母菌致死率lgS 與不同場強(qiáng)條件下的殺菌時間之間符合一級動力學(xué)，有良好的線性相關(guān)性，隨著場強(qiáng)的增加，k 值越來越小，殺菌越快，這點(diǎn)也與Fermi 模型中k 值的表述一致[7]。具體來看，圖1（a、b、c）中一定范圍內(nèi)相同場強(qiáng)條件下，處理時間越長，酵母菌致死率越高，在10 kV/cm條件下，當(dāng)有效處理時間從40 μs 增加至120 μs 時，對酵母菌的致死率約增加了3.5 log。隨著電場強(qiáng)度的提高，殺菌效果顯著增強(qiáng)。由圖1（a、c）可以看出，當(dāng)場強(qiáng)從10 kV/cm 增加至15 kV/cm 時，在相同有效處理時間40 μs 條件下，酵母菌的致死率約增加了2.3 log。在場強(qiáng)在15 kV/cm、處理時間80 μs 條件下，酒體溫度75 ℃，未檢出酵母菌，達(dá)到終止發(fā)酵的目的。對照熱滅菌處理需20 min 才能將酵母菌殺滅（表1），而脈沖有效處理時間僅80 μs，故脈沖電場滅菌過程中溫度升高對滅菌效果的影響可忽略。

圖1 不同場強(qiáng)和處理時間對酵母菌的致死情況（a，b，c）和線性關(guān)系（d）Fig.1 Lethal conditions of yeasts with different field strengths and treatment times (a, b, c) and Linear relationship (d)

2.1.2 熱滅菌和二氧化硫終止發(fā)酵法

Guyot 等[4]研究了釀酒酵母對熱的應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)果表明，溫度一定，加熱速度對酵母沒有顯著性影響，致死率僅與加熱時間相關(guān)。由表1 可知，隨著滅菌時間延長，酵母菌落總數(shù)急劇下降，在75 ℃處理20 min時，未檢出酵母菌，達(dá)到終止發(fā)酵的目的。高濃度二氧化硫能抑制酵母菌活動[3]，在濃度為150 mg/L 時酒精發(fā)酵終止，此時未檢出酵母菌。

表1 熱滅菌法和二氧化硫法處理低醇酒中酵母菌落總數(shù)Table 1 Total number of yeast colonies in low alcohol wine treated by thermal sterilization and sulfur dioxide

2.2 不同終止發(fā)酵方式對低醇菠蘿酒理化指標(biāo)的影響

通過對脈沖電場滅菌、熱處理、添加二氧化硫制備的菠蘿低醇酒的常規(guī)理化指標(biāo)和感官評價進(jìn)行分析，由表2 可知：三種終止發(fā)酵方式均能使果酒達(dá)到目標(biāo)酒精度，達(dá)到終止發(fā)酵目的，且殘?zhí)恰⒖偹?、干浸出物、揮發(fā)酸沒有顯著性差異，這與Darra[10]研究結(jié)果一致。根據(jù)GB 2760-2011 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，果酒中二氧化硫最大使用量0.25 g/L（最大量以二氧化硫殘留量計），三種菠蘿低醇酒含量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。即終止發(fā)酵方式對菠蘿低醇酒理化指標(biāo)影響不顯著。

表2 低醇菠蘿酒的理化指標(biāo)Table 2 Physical and chemical indicators of low alcohol pineapple wine

2.3 不同終止發(fā)酵方式對低醇菠蘿酒色澤的影響

表3 低醇菠蘿酒色澤變化Table 3 Color of low alcohol pineapple wine

不同終止發(fā)酵方式對果酒色澤的L*值、a*值、b*值差異顯著（p＜0.05），其中L*值、b*值為正值，a*值為負(fù)值，說明果酒色澤亮度上升，綠色黃色增強(qiáng)[11]。如表3 所示，SSO2樣L*值最高，L*值常被用來衡量食品的褐變程度，由于二氧化硫的漂白和抗氧化特性，導(dǎo)致果酒亮度明顯提升，脈沖電場處理也具有類似效果，Oms 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜汁在場強(qiáng)35 kV/cm、處理時間為1050 μs 時，甜瓜汁的抗氧化能力達(dá)到最高，但效果不如添加二氧化硫顯著。相比之下，熱處理大大增加了低醇菠蘿酒的褐變，是因為酒樣在終止發(fā)酵過程中由于溫度的升高還原糖、氨基酸等物質(zhì)經(jīng)過縮水、脫水、重排等一系列反應(yīng)發(fā)生褐變[12]，導(dǎo)致亮度降低。因此，脈沖電場法和二氧化硫法終止發(fā)酵技術(shù)比熱滅菌更適合于低醇菠蘿酒。

2.4 不同終止發(fā)酵方式對低醇菠蘿酒香氣成分的影響

圖2 低醇菠蘿酒香氣成分總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of aroma components of low alcohol pineapple wine

總香氣成分共檢出48 種，其中主要包括21 種酯類香氣物質(zhì)（44.50%～53.70%），6 種醇類香氣物質(zhì)（27.30%～40.70%），8 種酸類香氣物質(zhì)（11.30%～25.70%）。不同終止方式對發(fā)酵酒中檢測到的香氣成分含量差異較大。SPEF樣中構(gòu)成菠蘿重要香成分的2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、3-羥基己酸甲酯、4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮含量均有提升；特有乙酸橙花酯[13]、芳樟醇[14]、D-檸檬烯[15]等物質(zhì)使酒體具有甜玫瑰橙花花香、蘋果果香、愉悅的檸檬香；壬酸、2-甲基乙酸等[16]酸類品種的增加進(jìn)一步協(xié)調(diào)果酒的口感，相較于ST和SSO2酒樣香氣分析表現(xiàn)更好，香氣成分總離子流圖如圖2 所示。

酯類共檢出23 種，是含量最高的一大類。脈沖滅菌樣、熱滅菌樣和二氧化硫滅菌樣的酯類含量分別占總香氣含量的41.50%、43.50%、53.70%，二氧化硫樣的酯類占比量高于其他方式終止發(fā)酵處理后的樣品，是由于低沸點(diǎn)酯類在高溫或高壓的處理下?lián)]發(fā)所引起的[17]，未檢測到的乙酸乙酯推斷也是因為此。脈沖電場中2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、3-羥基己酸甲酯含量最高，是新鮮菠蘿香味的主要來源，賦予酒體新鮮水果香氣[13]。

醛酮類化合物共檢出6 種，揮發(fā)性醛酮給菠蘿酒帶來果香、堅果香和奶香[18]，其中菠蘿香氣成分4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮（0.46 mg/L、0.35 mg/L、0.39 mg/L）賦予菠蘿低醇酒甜的咖啡焦糖香[19]。

醇類化合物共檢測出9 種，脈沖滅菌樣、熱滅菌樣和二氧化硫滅菌樣的醇類含量分別占總香氣含量的27.70%、27.30%、28.50%。果酒中的雜醇油主要包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、活性戊醇、異戊醇和苯乙醇[20]，本研究中發(fā)酵過程中產(chǎn)生的苯乙醇，異戊醇是含量最高的兩種醇類，占總醇含量的90%以上，賦予酒體玫瑰香，且使得口感綿軟協(xié)調(diào)。

酸類化合物共檢出8 種，脈沖滅菌樣、熱滅菌樣和二氧化硫滅菌樣的酸類含量分別占總香氣含量的23.70%、21.90%、11.30%。脈沖終止樣中酸類成分檢出最多（8 種，16.12 mg/L），包括壬酸、2-甲基己酸、3-(4-乙基苯甲酰)丙酸、4-(2-羥基-乙基氨基)呋喃-3 羧酸，可使酒樣口感飽滿、醇厚，增加酒體層次感[19]。

其它化合物：除以上化合物外，果酒揮發(fā)性香氣中還含有8 種其它化合物，包括有特殊香氣的苯乙烯，僅在脈沖樣中檢出的D-檸檬烯有新鮮橙子香氣和檸檬香氣[14]。

表4 低醇菠蘿酒主要揮發(fā)性香氣成分Table 4 Main volatile aroma components of low alcohol pineapple wine

注：nd 表示未檢出該香氣物質(zhì)。

2.5 感官分析

圖3 低醇菠蘿酒感官分析雷達(dá)圖Fig.3 Sensory analysis radar chart of low alcohol pineapple wine

圖3是SPEF、ST、SSO2三組不同終止發(fā)酵方式釀造菠蘿低醇酒感官分析雷達(dá)圖。從香氣指標(biāo)分析，SPEF組菠蘿低醇酒評分9.5 分，有典型菠蘿香氣，風(fēng)味獨(dú)特，這是由于脈沖電場滅菌樣提高了酯類、高級醇種類和含量，豐富了菠蘿低醇酒香氣的復(fù)雜性和層次感；SSO2組酒體具有硫磺味，臭雞蛋味等不愉悅氣味，評分8.5 分。從外觀指標(biāo)分析，SPEF組色澤評分最高，9.2 分。從滋味指標(biāo)分析，三組酒樣的甜味、酸味基本一致，沒有顯著性差異。因此，采用脈沖電場滅菌法制備的低醇菠蘿酒具有更好的感官品質(zhì)。

3 結(jié)論

終止發(fā)酵方式對低醇酒生產(chǎn)至關(guān)重要。本文對脈沖電場滅菌、熱處理和添加二氧化硫等終止發(fā)酵條件進(jìn)行探討，結(jié)果表明當(dāng)場強(qiáng)在15 kV/cm，有效處理時間80 μs 或75 ℃恒溫水熱20 min 或添加150 mg/L 二氧化硫可達(dá)到終止發(fā)酵的目的。相較于兩種傳統(tǒng)終止發(fā)酵法，脈沖電場滅菌制備的菠蘿低醇酒在色澤上L*值、a*值升高，b*值降低，表明酒體亮度上升，綠色褪去，有效保持果酒色澤；在香氣成分含量上，SPEF樣中構(gòu)成菠蘿重要香成分的2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、3-羥基己酸甲酯、4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮含量均有提升。綜上所述，采用脈沖電場滅菌法能有效終止發(fā)酵，改善果酒色澤，增加菠蘿酒香氣復(fù)雜，果酒具有良好的感官品質(zhì)。