李玉龍，翟亞瑩，呂世杰，于 翔，朱肖亭，張志杰，張格陽(yáng)，張子敬，施巧婷，陳付英，徐照學(xué)，王二耀*

(1. 河南省農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 鄭州 450002；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 鄭州 450002;3. 河南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，鄭州 450003.)

DNA聚合酶β(DNA polymerase beta，POLB)屬于DNA聚合酶X家族中的一員，為Weisssbach等[1]在1971年首次發(fā)現(xiàn)。該家族成員還包含Polλ、Polμ以及末端轉(zhuǎn)移酶TdT等[2]。其主要功能是參與堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)系統(tǒng)對(duì)DNA損傷進(jìn)行堿基的切除以及修復(fù)。脫氧核糖核酸(Deoxyribonoulecic acid，DNA)是攜帶有合成RNA和蛋白質(zhì)所必需的遺傳物質(zhì)，是生物體發(fā)展發(fā)育和正常運(yùn)轉(zhuǎn)必不可少的生物大分子，DNA分子的穩(wěn)定性對(duì)機(jī)體很重要，它是機(jī)體內(nèi)各項(xiàng)生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。但是，細(xì)胞內(nèi)的DNA分子卻常常受到機(jī)體內(nèi)源性與外源性的各種有害信號(hào)的誘導(dǎo)致使DNA損傷。DNA損傷在細(xì)胞中如不能得到有效修復(fù)，易導(dǎo)致細(xì)胞的衰老、凋亡以及癌變等后果[3]。Wang等[4]研究證明，POLB在細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要作用。由于POLB表達(dá)下降使得上述的癌基因、抑癌基因(如ras、p53和Rb等)受到損傷后卻不能得到正確修復(fù)，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期的紊亂、增殖失控。因此，進(jìn)一步深入探討POLB在細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制中的作用，為畜禽品種的改善并開(kāi)發(fā)新的分子輔助標(biāo)記具有非常重要的意義。

1 POLB基因的結(jié)構(gòu)

在人體中POLB基因定位在第8號(hào)染色體的第P11-P12區(qū)，該基因橫跨范圍長(zhǎng)達(dá)14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子[5]。POLB蛋白分子質(zhì)量只有39 KD，是真核細(xì)胞中最小的DNA多聚酶[6]。從結(jié)構(gòu)上看，人和嚙齒動(dòng)物POLB蛋白由335個(gè)氨基酸組成，在蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中由螺旋(10%)和β片層(50%)組成[7-8]。POLB包含兩大重要的結(jié)構(gòu)域：8 KD的N-末端和31 KD的C-末端，N-末端具有5′-脫氧核糖磷酸裂解酶功能和單鏈DNA結(jié)合功能，C-末端具有雙鏈DNA聚合酶催化功能[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，C-末端分為三個(gè)亞區(qū)，一個(gè)“指部”亞區(qū)、一個(gè)“掌部”亞區(qū)、一個(gè)“拇指”亞區(qū)。另外，在N-末端內(nèi)有一個(gè)稱為螺旋-發(fā)卡-螺旋(helix-hairpin-helix,HhH)的結(jié)構(gòu)，此為POLB蛋白與DNA作用的重要區(qū)域[10]。1981年，Tanabe 等[8]人從多種哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中提取POLB蛋白并測(cè)定其分子量和分子結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)POLB蛋白在的中細(xì)胞中的分子量和分子結(jié)構(gòu)大致相同。Chang等[11]也研究發(fā)現(xiàn)POLB在哺乳類動(dòng)物中的同源性以及在結(jié)構(gòu)進(jìn)化過(guò)程中相當(dāng)保守，說(shuō)明其在哺乳類動(dòng)物中功能相似。

2 POLB基因的生物學(xué)功能

2.1 POLB基因參與DNA損傷修復(fù)

POLB基因參與堿基切除修復(fù)(Base excision repair，BER)主要發(fā)生在細(xì)胞核中。POLB位于BER修復(fù)過(guò)程的中心位置，起關(guān)鍵作用。POLB功能性研究結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)POLB表達(dá)量下降以及其表達(dá)產(chǎn)物活性降低，都將致使BER效率減弱，隨著B(niǎo)ER效率的減弱細(xì)胞對(duì)DNA損傷試劑的敏感性也越來(lái)越大，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。POLB的主要功能是擁有DNA 聚合酶活性，除此之外，POLB還可以切除被APE1切割而形成的5′-d RP基團(tuán)，這是其發(fā)揮了 5′-d RP裂合酶活性的作用。但是，POLB沒(méi)有 3′-5′位點(diǎn)的核酸外切酶活性，這導(dǎo)致DNA的突變率大大增加，其原因是其無(wú)法及時(shí)矯正錯(cuò)配的堿基[12]。POLB基因缺失、突變或功能的異常往往導(dǎo)致 DNA 損傷修復(fù)功能缺失[13-14]。進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)受損傷的 DNA 來(lái)不及被修復(fù)，基因的不穩(wěn)定性也將提高，從而致使細(xì)胞毒性以及突變產(chǎn)生[15]。另外，POLB能跨堿基AP位點(diǎn)(無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn))修復(fù)導(dǎo)致缺失及堿基置換型突變，成為保真度最低的DNA聚合酶。P53依賴性DNA的修復(fù)或凋亡的觸發(fā)取決于受損DNA積累的程度[16]，P53之所以能夠直接識(shí)別DNA損傷位點(diǎn)(包括BER位點(diǎn))信號(hào)并與其結(jié)合，那是因?yàn)镻53與含有1個(gè)或4個(gè)核苷酸缺失的DNA親和力最強(qiáng)。P53蛋白結(jié)構(gòu)的核心位置和其N-末端都能對(duì)BER產(chǎn)生影響，P53通過(guò)其N-末端與POLB蛋白相互作用。

2.2 POLB蛋白與支架蛋白結(jié)合發(fā)揮功能

參與BER 過(guò)程中的修復(fù)酶類，只能和DNA受損傷位點(diǎn)結(jié)合方能發(fā)揮其修復(fù)功能，而支架蛋白能夠?qū)⑦@些修復(fù)酶類送到DNA受損傷的位點(diǎn)，并為酶促反應(yīng)提供條件。增殖細(xì)胞核抗原(proliferative cell nuclera antigen，PCNA)是一種重要的支架蛋白，其與DNA合成和細(xì)胞增殖息息相關(guān)，在細(xì)胞有絲分裂周期中，PCNA在細(xì)胞分裂的G1后期(第一間隙期)和S期(DNA合成期)被合成，所以PCNA的表達(dá)量與細(xì)胞增殖關(guān)系密切，并能夠在客觀上反映細(xì)胞的增殖特性[17]。然而近年來(lái)，大量的證據(jù)表明 PCNA 蛋白能夠和多種蛋白結(jié)合并且還能夠參與到多條細(xì)胞代謝通路過(guò)程中去，其中包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA甲基化、DNA損傷修復(fù)等[18]。若POLB上的第137位精氨酸突變，PCNA與POLB的結(jié)合能力明顯降低且影響DNA的修復(fù)能力[19]。轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明，有R137Q突變體的小鼠細(xì)胞其BER 效率會(huì)下降且對(duì)外源DNA損傷劑抵抗力下降[20]。隨后 Wilson[21]團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)多聚核糖基化聚合酶1( Poly (ADP-ribose) polymerase 1 ,PAPR1)，并發(fā)現(xiàn)其與POLB結(jié)合成復(fù)合物直接影響 BER。另外研究發(fā)現(xiàn)，PAPR1 與POLB結(jié)合后，還能夠通過(guò)改變POLB的聚合酶活性也能影響 BER[22]。

2.3 POLB蛋白被翻譯修飾后的功能

POLB被PKC磷酸化會(huì)造成POLB聚合酶活性喪失[23]。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶6 (protein arginine methyltransferases 6,PRMT6)與蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 1 (protein arginine methyltransferases 1,PRMT1) 都會(huì)對(duì)POLB進(jìn)行甲基化修飾，然而，兩者對(duì)POLB修飾的位點(diǎn)和影響的功能有所不同。PRMT6 對(duì)POLB甲基化修飾能夠顯著提高POLB聚合酶活性，其甲基化的位點(diǎn)為POLB蛋白第 83 位和 152 位的精氨酸[24]。PRMT1對(duì)POLB甲基化修飾后，并不能改變POLB自身的 dRP 活力和聚合酶活力，而是阻礙了 PCNA 和POLB的結(jié)合，從而降低了DNA的修復(fù)能力，其甲基化位點(diǎn)在POLB第 137 位[25]。

2.4 POLB基因參與生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制

腫瘤細(xì)胞之所以能夠無(wú)限增殖，其原因是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路異常，導(dǎo)致信號(hào)分子過(guò)度表達(dá)或誘導(dǎo)凋亡的通路失活，從而引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖、抵抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活。人類、牛和嚙齒動(dòng)物POLB基因的啟動(dòng)子似乎主要是由與cAMP反應(yīng)元件(Cycli-AMP response element,CRE)結(jié)合的蛋白質(zhì)調(diào)控的，其中CREB/ATF家族(包括CREB、ATF1/2、CRèME-1等)能與CRE識(shí)別，促進(jìn)POLB表達(dá)[26]。CREB的轉(zhuǎn)錄活性受多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，經(jīng)典的調(diào)控通路有cAMP-PKA-磷酸化CREB、有絲分裂原激活的蛋白激酶通路(Ras-Raf-MAPK)、P38通路等[27]，CREB可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和分化等密切相關(guān)[28]。蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)在細(xì)胞信號(hào)傳遞中扮演者重要角色，其能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白就是PKA重要的下游轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)在食管癌細(xì)胞EC9706中PKA-CREB信號(hào)通路和p38MAPK-ATF2信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，兩者共同促進(jìn)POLB的表達(dá)，如果PKA和p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑被抑制劑干擾或阻斷，細(xì)胞中POLB表達(dá)量同樣也會(huì)受到抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖受阻、細(xì)胞的凋亡數(shù)量增加，對(duì)化療藥順鉑的敏感性也增強(qiáng)[29]。朱艷艷[30]利用甲基芐基亞硝胺(n-nitroso methylbenzylamine，NMBA)分別誘導(dǎo)POLB敲除與對(duì)照組的小鼠食管上皮組織，經(jīng)mRNA轉(zhuǎn)錄組芯片以及差異基因富集分析結(jié)果顯示，有33個(gè)基因與細(xì)胞增殖調(diào)控相關(guān)，有27個(gè)基因與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)，其中涉及到PI3K-AKT、MAPK-ERK、PLK1/CENP-A[31-32]等信號(hào)通路。任瀟毅等[33]采用RNA干擾技術(shù)抑制乳癌細(xì)胞MC F-7細(xì)胞中的POLB的表達(dá)，細(xì)胞的增殖和侵襲能力均受到顯著抑制。這與沈亮[34]的研究結(jié)果一致，其還認(rèn)為POLB可能通過(guò)P13K/Akt信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移進(jìn)行調(diào)控。

小RNA(microRNA, miRNA)是一類單鏈非編碼 RNA分子,長(zhǎng)度通常僅有18～24 bp，其可以與靶信使RNA特異性結(jié)合,進(jìn)而影響基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平過(guò)程中的表達(dá),發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[35]。POLB能夠通過(guò)調(diào)控miRNA進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。李嘉欣[36]研究發(fā)現(xiàn)，POLB通過(guò)調(diào)控miR-10b和miR-181b進(jìn)而調(diào)節(jié)cyclinA/CDK2影響細(xì)胞周期。王媛媛[37]研究表明，POLB可能是miR-499的作用靶點(diǎn)且miR-499與POLB結(jié)合，對(duì)EC9706和人食管癌細(xì)胞系KYSE30細(xì)胞有增殖抑制、凋亡促進(jìn)作用。張滿[38]等研究顯示，上調(diào)食管癌細(xì)胞 EC9706 中 miR-149 的表達(dá)可下調(diào)POLB的表達(dá)。上調(diào) miR-149-5p 的表達(dá)還可抑制腎癌細(xì)胞的增殖和遷移,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[39]。

3 POLB基因在動(dòng)物方面的研究進(jìn)展

目前關(guān)于POLB在動(dòng)物方面上的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。Pan等[20]通過(guò)POLB基因Rl37Q位點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)基因小鼠與正常同種的小鼠對(duì)比，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，POLB基因含有突變的胚胎發(fā)育至15.5 d、17.5 d和19.5 d的體型和體重都顯著低于對(duì)照組野生型小鼠的胚胎，同時(shí)，利用胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)進(jìn)行細(xì)胞水平上的驗(yàn)證，結(jié)果顯示POLB基因含有R137Q位點(diǎn)突變的細(xì)胞存在更高的凋亡比例。也有專家研究發(fā)現(xiàn)，POLB基因在MyoD缺失小鼠與正常小鼠的肢體肌肉中差異表達(dá)，表明POLB基因可能與的表達(dá)與肌肉發(fā)育相關(guān)[40]。但是POLB基因通過(guò)什么生物學(xué)途徑影響牛肌肉發(fā)育仍然需要進(jìn)一步研究。

4 展望

綜上所述，POLB基因在癌癥中研究的較多，但其與細(xì)胞的周期調(diào)控息息相關(guān)，推測(cè)其與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育有一定聯(lián)系，其在肌肉細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。POLB基因也是近期我們實(shí)驗(yàn)組利用選擇性清除從郟縣紅牛和安格斯牛篩選出來(lái)的在生長(zhǎng)發(fā)育差異顯著的候選基因，目前正在進(jìn)行細(xì)胞驗(yàn)證。希望能為郟縣紅?？焖贁U(kuò)繁提供理論基礎(chǔ)。