施巧婷，張子敬，滑留帥，馮亞杰，李志鋼，祁興磊，王玉海，許 斌，徐照學，王二耀*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,鄭州 45002；2.平頂山市畜牧技術推廣站，河南平頂山 467000；3.河南省泌陽縣夏南牛研究推廣中心,河南 泌陽 463700；4.南陽黃?？萍贾行?，河南南陽 473005；5.伊吾縣畜牧改良站，新疆 哈密 839300)

地方牛品種具有體軀高大結實、結構勻稱、耐粗飼、適應性強、抗病性強、性情溫順、遺傳性能較穩(wěn)定等優(yōu)點。是我國寶貴的種質(zhì)資源。但受引進品種影響，地方品種普遍存在品種退化、數(shù)量銳減等問題。牛胚胎移植技術可充分利用現(xiàn)有種質(zhì)資源，生產(chǎn)更多優(yōu)良種公、母畜，它是加速牛群改良和純種繁育進程，迅速提高中國牛群整體水平的重要而有效的手段。

通過超數(shù)排卵技術可以獲得更多可用卵子和胚胎。影響牛超數(shù)排卵效果因素較多，牛的品種、年齡、飼養(yǎng)管理、藥品種類劑量、環(huán)境條件、重復超排、超排及采胚技術熟練程度等都能影響超排效果[1-5]。本次試驗旨在分析河南肉牛繁育關鍵技術實施現(xiàn)狀，建立起一套適合于地方肉牛產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的超數(shù)排卵方案，探討切實有效的擴繁技術，以提高牛的超數(shù)排卵效率，使胚胎移植技術更好的為畜牧業(yè)生產(chǎn)服務。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

1.1.1 體牛的選擇 選擇夏南牛、南陽牛、郟縣紅牛母牛作為供體，所有供體牛體格健壯，無遺傳及傳染性疾病、寄蟲病、生殖系統(tǒng)疾病等，供體繁殖機能正常，生產(chǎn)性能良好，遺傳穩(wěn)定，系譜清楚，胎次在3胎以下。

1.1.2 試驗物品及器材 垂體促卵泡素(FSH)(加拿大進口)，400 mg/瓶(20 mL 稀釋)；氯前列烯醇(PG)上海市計劃生育科學研究所出品,每支 0.2 mg；2%鹽酸普魯卡因；MEM.Gibco公司生產(chǎn)，每份 9.73 g；保存液(Holding)，美國ICP公司出品，每袋50 mL；冷凍液，美國ICP公司生產(chǎn)每袋20 mL；程序冷凍儀(型號ET-1N)，日本富士平公司出品；體式顯微鏡，由德國卡爾蔡司公司(Carl Zeiss，型號：Stemi 305)生產(chǎn)，沖胚管、擴張棒、集卵杯、抽粘液棒購于北京綠欣康農(nóng)牧科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 供體牛超排方法 采用兩次PG+FSH法，具體操作方法如下：發(fā)情周期任意一天肌肉注射PG 2 mL記為第1天，第12天第二次肌肉注射PG 2 mL，第23天連續(xù) 4d遞減注射FSH，并在注射 FSH 的第 3 天下午注射 PG 2 mL。用藥劑量根據(jù)牛的體重是否經(jīng)產(chǎn)等因素確定。供體牛發(fā)情后進行人工授精。

1.2.2 牛胚胎采集方法 供體牛發(fā)情后人工授精的第 7天采用二路沖胚管法進行非手術沖胚。首先將供體牛保定，用2%普魯卡因4 mL進行薦尾間隙硬膜外腔麻醉，劑量為 4～6 mL，用子宮頸粘液去除棒吸除粘液。將帶鋼芯的沖胚管插入陰門，達到子宮頸口。用直腸把握法將沖胚管導入子宮頸和子宮角。當沖胚管前端到達子宮角前端，給沖胚管氣囊充氣約 8～15 mL，抽出沖胚管內(nèi)芯；用100 mL 注射器吸取沖胚液從輸入管注入子宮角，然后回收沖胚液，每側子宮反復 4～5 次，每個子宮角用 500 mL 沖胚液，將回收液收集集卵杯在室溫下(18 ℃～22 ℃)靜置5～10 min，鏡檢。

1.2.3 胚胎級別鑒定 根據(jù)胚胎的輪廓、細胞發(fā)育的均勻性、細胞的色澤等將胚胎分為 4 級。A 級：優(yōu)良胚胎，形態(tài)典型、卵細胞和分裂球的輪廓清晰、細胞質(zhì)致密、色澤和分布均勻一致；B級：普通胚胎，與典型的胚胎相比，稍有變形，但卵細胞和分裂球的輪廓清晰、細胞質(zhì)較致密、分布均勻、水泡樣和變性細胞占10%～30%；C 級：不良胚胎，形態(tài)變化明顯，卵細胞和分裂球的輪廓稍不清晰或部分不清晰、細胞質(zhì)不均勻、色澤發(fā)暗、水泡樣和變性細胞占 30%～50%；D 級：變性、退化胚胎。其中A、B級胚胎為可用胚。

1.3 統(tǒng)計方法

依據(jù)胚胎鑒定分級法對各組回收的胚胎進行鑒定分級，統(tǒng)計各組總的胚胎數(shù)、可用胚數(shù)。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理試驗數(shù)據(jù)。依據(jù)下列公式計算可用胚率和一級胚胎率，可用胚率=可用胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%，采用2個樣本百分數(shù)差異顯著性檢驗(t法)分別對各組可用胚率作差異性檢驗。

2 結果

表1 河南三種地方牛超排結果分析

由表1可知夏南牛超排7頭獲得90枚胚胎，其中69枚可用，可用胚9.86枚/頭，南陽?？捎门?.71枚/頭，郟縣紅牛為6.75枚/頭，可用胚中夏南牛最高與郟縣紅牛和南陽牛有顯著性差異(P<0. 05)。可用胚率郟縣紅牛最高79.41%，夏南牛喂76.67%，顯著高于南陽牛(P<0.05)。

3 討論

影響牛超排效果的因素較多，牛的品種、營養(yǎng)水平、超排處理方法、激素種類及沖胚技術的嫻熟度等對超排效果均有影響[1-5]。本試驗采用PGF2+FSH處理河南三種地方肉牛，獲得比較好的效果。

近年來中國奶牛體內(nèi)生產(chǎn)和胚胎移植數(shù)量正在逐漸減少，引入肉牛品種體內(nèi)胚胎生產(chǎn)有增加的趨勢，每頭平均有用胚胎為5.7～7.0枚[5]。牛的品種會影響超排效果，但地方品種牛超數(shù)排卵效果差。對奶牛(頭均1.2～7.2枚)，可用胚率可達到76.3%[6]。Huseyin Erdem超排西門塔爾牛，146頭牛獲得618枚可用胚，頭均4.23枚[7]。Fernando Naranjo-Chacón在熱帶地區(qū)超排瘤牛×家牛，可用胚達到5.9枚[8]。王木等[9]報道南陽黃牛頭均有用胚數(shù)為2.89枚；李金輝等[10]報道秦川牛頭均有用胚數(shù)為4.20枚；喬利敏等枚[11]報道晉南牛頭均有用胚胎數(shù)為3.90；王新莊等[12]報道郟縣紅牛頭均有用胚數(shù)為4.28枚；胡在鉅等[13]報道廣西南丹黃牛頭均有用胚數(shù)為4.40枚。朱芳賢對復州牛進行了47頭次超數(shù)排卵處理，頭均回收卵子數(shù)7.98枚，其中頭均有效胚數(shù)4.62枚[14]。但王峰[15]對荷斯坦牛、西門塔爾、海福特、安格斯、利木贊、夏洛萊進行了超數(shù)排卵實驗，表明相同超排處理方法可用胚，除夏洛萊無顯著性差異，夏洛萊頭均可用胚較低(4.41±3.56)枚 。我們超排處理了河南地方三種肉牛，三種牛超排后可用胚數(shù)均超過7枚，高于以上報道，說明三種河南地方肉牛都具有很好的繁殖性能，可以用胚胎移植方法快速擴繁。

超排方法對超排效果也有顯著影響。寧財?shù)炔捎萌毡具M口FSH處理錦江牛獲得胚胎數(shù)5.8枚和可用胚3.8枚稍高[16]，與薛仰全等采用CUE+MATE孕酮栓+FSH+PGF2α處理奶牛獲得頭均可用胚4.86枚相當[17]。FSH劑量可以影響胚胎數(shù)量和質(zhì)量，在實踐中掌握牛的胎次及年齡，確定合適的FSH劑量方能達到較好的超排效果[2,4-5]。營養(yǎng)和環(huán)境因素對超排母牛也有影響[3]，應盡量規(guī)避和降低不良應激因素對牛體的影響。本次3種供體牛飼養(yǎng)管理和所處的環(huán)境不同，所用激素和處理方法相同，采胚操作是同一人完成，牛個體對激素應答反應有差異，可能是超排效果有差別的原因。筆者經(jīng)驗認為，經(jīng)產(chǎn)牛第一針PG處理時清宮可以獲得等多的可用胚。

河南的規(guī)模化牛場大都具備做牛超數(shù)排卵、胚胎移植的條件，基本掌握牛同期發(fā)情、超數(shù)排卵及胚胎移植等技術及流程，但在技術細節(jié)上還需要加強和提高，主要表現(xiàn)在供體牛的選擇，清宮及沖胚技術等方面。在實際生產(chǎn)中，一些牛場在選擇供體牛時，只選擇外表和繁殖器官正常，無明顯的繁殖性疾病的母牛，我們認為還應當查看牛只配種檔案，挑選體格健康、情期受胎率高、繁殖性能優(yōu)良的母牛作為超數(shù)排卵母牛，才能確保繁育技術的高效和穩(wěn)定。另外，沖胚技術的熟練程度對胚胎回收率和母牛健康有很大影響，生產(chǎn)實踐中也應加強和提高。

4 結論

試驗采用兩次PG+ FSH的方法對河南省肉牛超數(shù)排卵效果良好，獲得的總胚胎數(shù)、可用胚數(shù)及可用胚率，較國內(nèi)同行超排獲得胚胎數(shù)多，可用胚率高，試驗結果為今后肉牛繁育技術的更廣泛開展提供參考。