陳詩樺 焦 陳# 金艷花 金福植

（延邊大學(xué)，1 醫(yī)學(xué)院，2 再生醫(yī)學(xué)研究所，3 附屬醫(yī)院西區(qū)醫(yī)院，延吉 133000）

脊椎動物的發(fā)育在直系同源基因組的調(diào)控下，首先創(chuàng)建身體軸—前后軸（anterior-posterior，AP）、背腹軸（dorsal-ventral，DV）和左右軸（left-right，LR）以及胚層—內(nèi)胚層、中胚層和外胚層，然后逐漸發(fā)育成各種成體形態(tài)。這一系列的發(fā)育過程都體現(xiàn)了動物本身的自組織潛能。自組織（self-organization）是一個系統(tǒng)在自組織機制的作用下，其組織結(jié)構(gòu)不斷自我完善，自動地由無序走向有序，由低級走向高級，從而提高對環(huán)境適應(yīng)力的過程。組成胚胎的各種固定成分可能被誘導(dǎo)自組織成一個完整的胚胎系統(tǒng)。胚胎發(fā)育的多級調(diào)控增加了其穩(wěn)定性，但是這種繁冗的過程使得調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，比如信號傳導(dǎo)控制的上皮細(xì)胞極化過程。而胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）來源于囊胚植入前的早期胚胎，具有發(fā)育全能性。因此，用胚胎干細(xì)胞[1]構(gòu)建體外干細(xì)胞模型進(jìn)行胚胎學(xué)研究，可以脫離上述復(fù)雜的調(diào)控來揭示胚胎發(fā)育的動態(tài)過程。

1 自組織的基本原理

自組織原理是研究胚胎系統(tǒng)自組織機制的基礎(chǔ)，對幫助了解系統(tǒng)的有序建立及其穩(wěn)定性的維持意義重大。自組織的方式主要包括細(xì)胞重排（cell rearrangement）和細(xì)胞命運特化（cell fate specialization）。

1.1 細(xì)胞重排

在早期胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞自組織成黏著性的上皮層，不斷地生長和重排，而不會失去其完整性，從而產(chǎn)生了各種各樣的組織形狀。細(xì)胞重排導(dǎo)致原有的對稱性被破壞，如何打破最初的對稱性以引發(fā)不同的細(xì)胞命運，最經(jīng)典的理論是圖靈的反應(yīng)擴散模型，即緩慢擴散的激動劑和快速擴散的抑制劑周期性變化。激動劑和抑制劑都可以看成一種形態(tài)發(fā)生素，它們擴散形成濃度梯度，梯度實際上就破壞了對稱性，稱為激動劑-抑制劑的形態(tài)發(fā)生模式。該模型的產(chǎn)生基于形態(tài)發(fā)生素的相互作用，在反應(yīng)擴散模型中，如果一個形態(tài)發(fā)生素在一定程度上誘導(dǎo)自身抑制劑的表達(dá)，那么兩個相互作用的形態(tài)發(fā)生素的濃度將因擴散速度不同產(chǎn)生周期性變化。說明細(xì)胞重排可能取決于其表達(dá)的形態(tài)發(fā)生素在濃度梯度中的位置。

激動劑和抑制劑對原腸胚形成的調(diào)節(jié)都可見于小鼠胚胎[2]，基于圖靈模型做一推理：激動劑在一定程度上誘導(dǎo)其自身抑制劑的產(chǎn)生，但抑制劑在組織中的擴散比激動劑更快。結(jié)果在某一區(qū)域，激動劑和抑制劑的峰值表達(dá)在同一位置，而不是相反位置，在其他區(qū)域，或是激動劑占優(yōu)勢或是抑制劑占優(yōu)勢。因為信號通路通常涉及分泌抑制劑，那么用圖靈模型解釋的細(xì)胞重排可能是通過改變激動劑和抑制劑峰值表達(dá)的位置，實現(xiàn)對特定信號通路的調(diào)控，從而破壞細(xì)胞原有的對稱性。

1.2 細(xì)胞命運特化

在發(fā)育和整個生命過程中，必須生成各種特化細(xì)胞以確保每個組織和器官的正常功能，即細(xì)胞發(fā)生命運特化。影響細(xì)胞命運特化的因素有許多，如染色質(zhì)影響細(xì)胞重排，并決定細(xì)胞命運[3]；細(xì)胞外相互作用控制細(xì)胞幾何形狀[4]。 除此之外，在細(xì)胞間傳導(dǎo)的趨化細(xì)胞因子也決定著細(xì)胞命運。

細(xì)胞間相互作用對維持特定的調(diào)節(jié)狀態(tài)至關(guān)重要，組成特定組織的細(xì)胞表達(dá)相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)狀態(tài)，即細(xì)胞命運特化所必需的信號（趨化細(xì)胞因子）在細(xì)胞間持續(xù)傳導(dǎo)。例如：μcolony模型（μcolony model）中，趨化細(xì)胞因子在多能性或骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）作用時促進(jìn)集落內(nèi)細(xì)胞實現(xiàn)共同命運。1988年Gurdon等[5-6]在植物細(xì)胞誘導(dǎo)非洲爪蟾動物帽細(xì)胞向肌肉細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程中觀察到了共同命運現(xiàn)象，稱為集團效應(yīng)（community effect）。

2 胚胎早期的自組織現(xiàn)象

受精等一系列過程逐步引發(fā)胚胎細(xì)胞進(jìn)行命運特化，最終形成含有胚胎上胚層、胚外原始內(nèi)胚層和滋養(yǎng)層等3種細(xì)胞類型的囊胚[7-8]。哺乳動物的發(fā)育在囊胚植入前相當(dāng)保守[9]，但從植入到原腸胚形成，胚胎發(fā)育的調(diào)控機制逐漸復(fù)雜化，并涉及很多自組織現(xiàn)象。

2.1 胚胎自組織作用

囊胚植入開啟了母體子宮和胚胎之間的信息交流，導(dǎo)致胚胎和母體間發(fā)生組織重組。但比較胚胎學(xué)指出，母體子宮和胚胎之間的信息交流不是哺乳動物胚胎早期形態(tài)發(fā)生的必須條件。例如，人類胚胎發(fā)生的關(guān)鍵階段是在沒有任何母體組織的情況下進(jìn)行的[10]；在豬、兔和牛等哺乳動物的胚胎中，胚胎形態(tài)發(fā)生和原腸胚形成（morphogenesis and gastrulation）都在囊胚植入前進(jìn)行[11-12]。且不同物種哺乳動物的組織間基本關(guān)系雖然相對保守，但從小鼠的圓柱形胚胎到人類的二胚層胚盤胚胎，囊胚植入后皆在母體中呈現(xiàn)出了不同的胚胎結(jié)構(gòu)。以上均說明哺乳動物胚胎具有很強的自組織能力，并且可以肯定的是，囊胚植入前的早期胚胎形態(tài)發(fā)生主要依賴于胚胎自組織，植入后再由子宮內(nèi)環(huán)境幫助完善[13-14]。

2.2 胚胎與胚外組織的相互作用

胚胎和胚外組織之間的相互作用對胚胎結(jié)構(gòu)的塑造至關(guān)重要。在小鼠中，極性滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞在上胚層分泌的成纖維細(xì)胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GF4）的作用下增殖為胚外外胚層[15]，并將繼續(xù)發(fā)育成胎盤；前臟壁內(nèi)胚層（anterior visceral endoderm，AVE）分泌的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）可以刺激上胚層和外胚層逐漸形成管腔[13，16]，然后融合成羊膜腔[17]。這是構(gòu)建小鼠身體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，也與AVE成為前部信號傳導(dǎo)中心時發(fā)生的對稱性破壞事件相符合—即胚外組織在哺乳動物胚胎中的作用可能不是誘導(dǎo)身體軸的形成，而是誘導(dǎo)早期胚胎的對稱性破壞[18-19]。在人類胚胎中，上胚層形成管腔的方式類似小鼠，其中一個重要區(qū)別是：與滋養(yǎng)層接觸的上胚層形成羊膜上皮，而與下胚層（與AVE等效）接觸的上胚層形成上胚層胚盤[1，9，20]。

3 胚胎相關(guān)干細(xì)胞的自組織研究

在上述自組織原理基礎(chǔ)上，體外胚胎干細(xì)胞模型被提出并不斷完善，更大程度地還原了早期胚胎發(fā)育過程，包括微圖案化培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞自組織模型、3D細(xì)胞培養(yǎng)的干細(xì)胞自組織模型、類原腸胚（gastruloids）模型等。

3.1 微圖案化（micropatterns）培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞自組織

基于人類胚盤（embryonic disc）圓盤狀的特性和ESCs能夠分化為上胚層的特性，可以通過微圖案化培養(yǎng)建立胚胎干細(xì)胞體外二維模型進(jìn)行自組織過程的研究。在微圖案化培養(yǎng)過程中，需要限制ESCs生長集落的大小和形狀[21]，并且添加BMP4以提供形態(tài)發(fā)生素（morphogen）引發(fā)物來模擬胚外滋養(yǎng)層環(huán)境。在這個環(huán)境中，ESCs首先以幾何約束的方式逐漸生長發(fā)育為胚外內(nèi)胚層（extraembryonic endoderm，XEN），模擬的胚外滋養(yǎng)層環(huán)境再繼續(xù)誘導(dǎo)ESCs發(fā)育成細(xì)胞分布不同的三胚層胚胎[22]。中、內(nèi)胚層細(xì)胞都表達(dá)了相同的標(biāo)志物Nanog、Brachyury，并受Wnt和Activin/Nodal誘導(dǎo)的BMP4下游信號調(diào)控。而外胚層在分泌抑制因子的保護下免受形態(tài)發(fā)生素的影響，相同的分泌抑制因子同時限制原條（primitive streak）空間發(fā)生。因此，在最初的ESCs自組織過程中，一層均勻分布的hESCs可以在大約2 000個細(xì)胞的范圍內(nèi)自構(gòu)型（self-pattern）而不受胚外組織的影響。不僅如此，微圖案化培養(yǎng)還可以方便探究ESCs自組織過程中影響細(xì)胞命運的因素。

細(xì)胞距集落邊界的距離與細(xì)胞命運息息相關(guān)。極化上皮細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)過程十分復(fù)雜，人胚胎干細(xì)胞（human ESCs，hESCs）通過頂面—底側(cè)極性化[23]（apicobasally polarized），使BMP、Activin、Nodal受體位于基底側(cè)，除了集落邊緣的細(xì)胞，其他位置的ESCs都不能通過頂端的配體接受信號，從而阻礙中心的細(xì)胞一系列信號傳導(dǎo)過程。而細(xì)胞分泌的BMP抑制劑Noggin（頭蛋白）又抑制信號向集落邊緣傳導(dǎo)，當(dāng)BMP抑制信號開始傳導(dǎo)時，信號只能有序地從頂端開始激活。這樣，距集落邊界不同距離的細(xì)胞通過激活或抑制不同路徑的信號傳導(dǎo)，使中心細(xì)胞和邊緣細(xì)胞的發(fā)育走向不同方向[24]。

通過對ESCs頂面—底側(cè)極性化發(fā)生的受體分布差異進(jìn)行空間定位，能夠了解為什么羊膜腔（面朝外胚層頂側(cè)）不會短接形成近—遠(yuǎn)端形態(tài)（proximal-distal patterning），以及初始BMP反應(yīng)只在近端發(fā)生卻能誘導(dǎo)、調(diào)控遠(yuǎn)端側(cè)原條衍生物生長發(fā)育的原因[24-25]。通過這樣的ESC體外二維模型能夠方便探究影響小鼠原條衍生物發(fā)育的幾何、化學(xué)因素。

3.2 3D細(xì)胞培養(yǎng)的干細(xì)胞自組織

ESCs和胚外干細(xì)胞（extraembryonic stem cells）已被證實在3D細(xì)胞培養(yǎng)中可發(fā)生自組織[26-30]。ESCs的3D細(xì)胞培養(yǎng)方法較微圖案化培養(yǎng)更貼近真實胚胎發(fā)育情況，還能夠控制ESCs之間在生長時的相互作用力和化學(xué)因素對自組織的作用。

利用3D細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行胚胎干細(xì)胞自組織研究，需要將hESCs置于3D軟凝膠培養(yǎng)基上，并在其中摻雜入低濃度的ECM成分[31-32]，這種處理可以誘導(dǎo)細(xì)胞團根據(jù)原始細(xì)胞密度折疊形成封閉的極化殼，即頂?shù)讟O性殼（apicalbasal polarized shell），產(chǎn)生鱗狀、柱狀或不對稱的囊。鱗狀囊是一種具有鱗狀上皮細(xì)胞形態(tài)，但不表達(dá)干性標(biāo)志物Nanog、Oct4和Sox2，由BMP信號調(diào)控[31]的羊膜樣組織。而柱狀囊將發(fā)育成外胚層，不對稱囊則經(jīng)歷對稱性破壞事件形成植入后羊膜囊胚[32]（post-implantation amniotic sac embryoid，PASE）。這種由hESCs自組織形成的不對稱囊胚，類似于人羊膜囊植入后的階段，其特征是中央羊膜腔被連續(xù)的上皮細(xì)胞包圍，在BMP的作用下，通過Wnt信號調(diào)控，極化并破壞對稱性[33]，從而形成原始外胚層和后部原條（posterior primitive streak）。

根據(jù)這些結(jié)構(gòu)的形成過程，推測由此產(chǎn)生的羊膜囊的形態(tài)發(fā)生可能依賴于Snai1調(diào)控[32]的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并且需要BMP在假定的上胚層誘導(dǎo)Brachyury 表達(dá)，但其中的對稱性破壞機制仍然未知。該ESC體外3D模型對人類植入后羊膜囊發(fā)育的多個事件進(jìn)行模擬，從而進(jìn)一步理解胚胎形態(tài)發(fā)生的調(diào)控和細(xì)胞命運特化。由于能夠在3D培養(yǎng)凝膠表面定位，未來的研究將可以闡明形態(tài)學(xué)如何影響細(xì)胞間信號傳導(dǎo)。

3.3 基于擬胚體（embryoid bodies，EB）的干細(xì)胞自組織

EB是由ESCs在體外通過分化而形成的三胚層結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)，細(xì)胞的分化依賴于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和形態(tài)發(fā)生素梯度分布；在體外EB模型中，這一特點體現(xiàn)于原條的形成，主要與Wnt信號通路的局部激活有關(guān)[34]。在Wnt信號通路介導(dǎo)的激活域，ESCs經(jīng)歷了EMT，并分化為中胚層祖細(xì)胞，在外源性Wnt3a蛋白作用下，繼續(xù)分化成中胚層。這樣的EB體外分化模型為激發(fā)干細(xì)胞的自組織潛能提供了另一種方法：一組mESCs經(jīng)Wnt激動劑處理后，會經(jīng)歷對稱性破壞，自組織成一個表達(dá)身體軸—AP、DV和LR軸[35]的管樣組織，被稱為類原腸胚，與體內(nèi)早期胚胎明顯相似。

基于EB的ESCs自組織模型，即類原腸胚的形成過程與時間順序和胚外組織中信號的空間分布[36]緊密聯(lián)系，由Wnt /β-catenin與Nodal信號轉(zhuǎn)導(dǎo)精確控制，在恰當(dāng)?shù)臅r間順序和嵌套的伸縮域重現(xiàn)了原腸胚形成時胚胎基因表達(dá)的“時空”模式，比如39個HOX基因[37]按順序地激活，以調(diào)控胚胎枕后區(qū)域的形成。這樣的胚胎干細(xì)胞體外模型模仿體內(nèi)早期胚胎真實的基因“時空”表達(dá)模式，并且體現(xiàn)身體軸基因調(diào)控系統(tǒng)的特征，展示了類原腸胚模型研究哺乳動物早期胚胎發(fā)育調(diào)控過程的優(yōu)越性。

3.4 胚外干細(xì)胞的自組織

ESC模型揭示了同類細(xì)胞群如何通過自組織過程產(chǎn)生不同的細(xì)胞命運。然而，這些模型無法最真實地模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育，其不足之處在于它們?nèi)狈ε咄饨M織，而胚外組織對胚胎發(fā)育至關(guān)重要，并為信號傳導(dǎo)的相互作用提供了空間環(huán)境。不同類型的干細(xì)胞之間不僅能相互傳遞信號，而且每個干細(xì)胞都是胚胎空間形態(tài)發(fā)生的基礎(chǔ)，因此，在胚胎干細(xì)胞與胚外干細(xì)胞相互作用的前提條件下，經(jīng)過自組織過程很可能會形成類原腸胚結(jié)構(gòu)，誕生了新的干細(xì)胞胚胎模型[38-40]。

將mESCs與滋養(yǎng)細(xì)胞干細(xì)胞（trophoblast stem cells，TSCs）結(jié)合在ECM中進(jìn)行培養(yǎng)[38]，形成了一個形態(tài)發(fā)生與天然胚胎明顯相似的植入后胚胎樣結(jié)構(gòu)。在該模型中，細(xì)胞在Nodal信號[38]的調(diào)控下，開始自組織，發(fā)生極化，并在ESCs衍生的胚胎和TSCs衍生的胚外區(qū)室中形成管腔，然后相互融合。這樣的胚胎模型被稱為“ETS胚胎[38]”。ETS胚胎形成過程中，響應(yīng)Wnt和BMP信號，于ESCs和TSCs的交界處出現(xiàn)中胚層和原始生殖細(xì)胞標(biāo)志物及Brachyury不對稱表達(dá)域。較之僅使用ESCs來源的結(jié)構(gòu)（如擬胚體），ETS胚胎能更貼近地模擬體內(nèi)早期胚胎結(jié)構(gòu)的形成和基因表達(dá)的“時空”模式。

這樣的極化胚胎樣結(jié)構(gòu)仍具有局限性，雖然能誘導(dǎo)中胚層形成，但不繼續(xù)形成原腸胚。用第3種類型的干細(xì)胞—胚外內(nèi)胚層干細(xì)胞（extraembryonic endoderm stem cells）代替ECM進(jìn)行培養(yǎng)后，所形成的結(jié)構(gòu)在形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)和信號傳導(dǎo)等方面與植入后早期胚胎更為相似。這樣的結(jié)構(gòu)在活躍的BMP和Wnt信號調(diào)控下自組織形成的臟壁內(nèi)胚層（visceral endoderm，VE）成為一個信號中心，在腔隙融合的過程中通過促進(jìn)對Nodal和Wnt信號傳導(dǎo)的抑制作用控制AP軸發(fā)生和EMT，破壞胚胎和胚外邊界，從而形成中胚層和定形內(nèi)胚層（definitive endoderm）[40]。最后，可以觀察到依據(jù)胚胎發(fā)育時空特征表達(dá)出的原始生殖細(xì)胞標(biāo)記物。在這個過程中，ESCs遷移形成的中胚層，夾在外胚層和XEN衍生的AVE之間，而定形內(nèi)胚層會取代XEN成為早期到中期原腸胚形成的標(biāo)志，這指出了來自胚胎和2個胚外組織的細(xì)胞的正確編排是形成正常胚胎形態(tài)的根本條件。這樣的胚胎樣結(jié)構(gòu)植入小鼠母體后會誘導(dǎo)蛻膜反應(yīng)（decidua reaction），但不會進(jìn)一步發(fā)育。

干細(xì)胞模型具有很大的植入后發(fā)育潛能，將mESCs與TSCs在非貼壁條件下共同培養(yǎng)，可產(chǎn)生在形狀、基因表達(dá)和細(xì)胞間通訊方面與囊胚明顯相似的植入前胚胎樣結(jié)構(gòu)。其形態(tài)在更接近真實胚胎的胚外干細(xì)胞衍生物環(huán)境下能夠更加完善。同樣，最新發(fā)現(xiàn)的新型多能干細(xì)胞系EPS細(xì)胞，能夠形成胚胎和胚外組織，并為基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究開辟了新的途徑[41]。

4 總結(jié)與展望

胚胎發(fā)生相關(guān)的干細(xì)胞模型可以通過調(diào)控胚胎發(fā)育的幾何形狀、生長環(huán)境及改變實驗方法來探究胚胎和胚外組織相互作用，以解析經(jīng)典的胚胎發(fā)育過程。例如原腸胚形成是在形態(tài)不規(guī)則的胚胎樣結(jié)構(gòu)中進(jìn)行的，但目前還存在許多問題尚未解決：模型構(gòu)建初始是否需要調(diào)節(jié)該胚胎樣結(jié)構(gòu)形態(tài)以還原相同體內(nèi)生長環(huán)境；原條發(fā)生具體受哪些物理、化學(xué)信號調(diào)控；在沒有AVE的情況下能夠在多大程度上誘導(dǎo)原腸胚形成等。

胚胎無法植入是早期妊娠流產(chǎn)的主要原因，但是人類胚胎中此階段發(fā)生的細(xì)胞和分子變化仍然未知。為達(dá)研究目的，利用人類囊胚和子宮內(nèi)膜細(xì)胞的共培養(yǎng)模擬植入后形態(tài)發(fā)生的母體環(huán)境。然而，這些模型在多大程度上還原了人類胚胎植入后的發(fā)展，仍然是一個懸而未決的問題。因此，干細(xì)胞自組織模型能更好地闡述由形態(tài)和時間控制的遺傳決定因素如何調(diào)控早期胚胎發(fā)育。

構(gòu)建干細(xì)胞自組織模型時，胚胎干細(xì)胞團的每個成員都開始特化，并自組織成為胚胎，就像在體外從純化的組分中重建生化系統(tǒng)一樣，體現(xiàn)了從局部中理解整體的重要性。例如，“將hESC與人類TSC以及潛在的人類下胚層干細(xì)胞結(jié)合，可以重現(xiàn)人類母體妊娠過程”。但是由干細(xì)胞衍生而來的胚胎只是研究生物體發(fā)育的實驗?zāi)Ｐ?，因此它們不能完全重現(xiàn)生物體發(fā)育過程中的所有復(fù)雜性。這是胚胎干細(xì)胞模型的局限性，也是未來研究需要解決的問題之一。干細(xì)胞胚胎學(xué)領(lǐng)域正處于起步階段，未來實驗研究將通過優(yōu)化調(diào)整相關(guān)化學(xué)和物理參數(shù)以及選用具有更大發(fā)育潛能的干細(xì)胞系來促進(jìn)干細(xì)胞自組織模型的發(fā)展并擴展其應(yīng)用前景。