梁銳 李蕾蕾 王志強

腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個復雜且多步驟的過程，其中腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）發(fā)揮著舉足輕重的作用。TME 是指腫瘤癌巢內和間質中存在的眾多免疫細胞、間質細胞、細胞外基質及活性介質。TME 大體上可分為免疫細胞為主的免疫微環(huán)境和成纖維細胞為主的非免疫微環(huán)境兩大類。其中，免疫微環(huán)境是TME 的重要組成部分，主要由腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）以及其他免疫細胞組成。TME 與腫瘤細胞之間相互作用，最終影響著腫瘤的進展與結局。

1 TILs 的概述

1.1 TILs 的定義和發(fā)現(xiàn)

TILs 是指存在于腫瘤實質和腫瘤間質內的以T細胞為主的一類異質性淋巴細胞群體。1986年Rosenberg 等[1]從荷瘤小鼠腫瘤組織（如肉瘤、結腸腺癌）中發(fā)現(xiàn)并分離獲得TILs。

1.2 TILs 的構成和表型

TILs 主要由T 細胞、B 細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、巨噬細胞（macrophage，Mφ）和髓系來源抑制細胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）等組成，以T 細胞成分為主。其中，T 細胞包括輔助性T 細胞（hepler T cell，Th）、細胞毒性T 細胞（cytotoxic T cell，CTL）和調節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）。DC細胞包括參與免疫應答的DC1 型和參與免疫耐受的DC2 型。Mφ 細胞包括經典活化的M1 型和選擇性活化的M2 型。

大多數TILs 中的T 細胞都有CD3 表型。在此基礎上，Th 細胞表面還表達CD4，被稱為CD4+T 細胞，該類型T 細胞又根據其分泌的細胞因子不同分為Th1、Th2、Th9、Th17、Th22 細胞；CTL 細胞表面還表達CD8，被稱為CD8+T 細胞；Treg 細胞表面還表達轉錄因子FOXP3，被稱為FOXP3+T 細胞。

2 TILs 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的雙向作用

TILs 由不同的功能亞群構成，一部分細胞促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而另一部分細胞抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。TILs 各亞群對腫瘤免疫的影響是相互平衡、相互適應的結果，同時也是機體抗腫瘤免疫反應與腫瘤免疫逃逸之間的博弈，這種相互作用不僅影響著腫瘤的發(fā)生及后續(xù)的發(fā)展，而且對機體免疫系統(tǒng)的調節(jié)和重塑也起到重要的作用。

2.1 TILs 的抗腫瘤作用

2.1.1 TILs 抗腫瘤作用的效應細胞 在TILs 亞群中，CD8+CTL 細胞、CD4+Th1 細胞、B 細胞、NK 細胞、M1 型Mφ 和DC1 型細胞等可發(fā)揮抗腫瘤的免疫應答，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2.1.2 TILs 抗腫瘤作用的機制 上述效應細胞的抗腫瘤機制主要通過促進腫瘤殺傷作用和促進腫瘤凋亡實現(xiàn)的。CTL 細胞是人體抗腫瘤免疫的主要效應細胞，通過穿孔素/顆粒酶途徑、Fas/FasL 途徑和TNFTNFR 途徑發(fā)揮特異性殺傷作用。Th1 細胞：1）在CD8+T 細胞激活中起重要輔助作用；2）分泌細胞因子（如IFN、TNF）和趨化因子間接參與抗腫瘤免疫效應；3）可直接殺傷腫瘤細胞。B 細胞：通過抗體依賴性的細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC）激發(fā)抗腫瘤免疫。NK細胞：通過ADCC 途徑、Fas/FasL 途徑、穿孔素/顆粒酶途徑、釋放TNF 等細胞因子殺傷腫瘤細胞。M1型Mφ：1）非特異性吞噬腫瘤細胞；2）通過ADCC 途徑殺傷腫瘤細胞；3）分泌TNF、NO 等細胞毒性因子間接殺傷腫瘤細胞。DC1 型細胞：1）參與固有免疫應答；2）啟動適應性免疫應答；3）分泌細胞因子和趨化因子調節(jié)其他免疫細胞的功能。

2.2 TILs 的促腫瘤作用及機制

2.2.1 TILs 促腫瘤作用的效應細胞 在TILs 亞群中，F(xiàn)OXP3+Treg 細胞、CD4+Th2 細胞、M2 型Mφ、DC2型細胞和MDSC 可發(fā)揮免疫抑制的作用，促進腫瘤的生長。

2.2.2 TILs 促腫瘤作用的機制 這些效應細胞可以通過分泌細胞因子或相互之間的直接接觸，對免疫應答進行直接或間接地調控，從而使腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視，最終導致腫瘤形成、侵襲與轉移。Treg 細胞：1）表達高親和力IL-2 受體，競爭性消耗IL-2，導致T細胞凋亡；2）對抗原提呈細胞進行負向調節(jié)；3）以穿孔素/顆粒酶途徑殺傷效應T 細胞或抗原提呈細胞；4）分泌細胞因子如IL-10、IL-35 和TGF-β 等，抑制靶細胞活化和增殖。Th2 細胞：產生IL-4 激活Th2 亞群專一性轉錄因子Gata-3，從而抑制IFNG 基因轉錄。M2型Mφ：僅有較弱抗原提呈能力，主要通過分泌細胞因子IL-10、TGF-β 等下調免疫應答。DC2 型細胞：未成熟DC 參與外周免疫耐受的誘導，胸腺DC 參與中樞免疫耐受的誘導。MDSC 細胞：1）抑制免疫細胞發(fā)揮固有性免疫和適應性免疫功能；2）通過促進腫瘤血管生成、腫瘤細胞侵襲及轉移等非免疫機制。

3 TILs 免疫療法的研究進展

TILs 免疫療法是一種腫瘤被動免疫治療的方法，它是指給機體輸注外源性免疫效應細胞（TILs）在宿主體內發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.1 TILs 免疫療法的最早嘗試

有研究報道[1]從小鼠腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)并分離了TILs，在體外實驗中加入少量IL-2 培養(yǎng)擴增后，其抗腫瘤作用比淋巴因子激活殺傷細胞（lymphokineactivated killer cells，LAK）強50~100 倍，當其擴增到一定數量后重新回輸到帶瘤小鼠體內，能夠有效地控制肝、肺轉移灶的生長，甚至可使有些小鼠的轉移灶和原發(fā)灶的腫瘤完全消除。隨后，該研究組在惡性黑色素瘤相關動物模型中也取得了相似的結果。此后，越來越多的研究人員從事TILs 的分離、制備和應用研究，使TILs 免疫治療逐步從體外實驗迅速轉化為臨床試驗。

3.2 處于體外實驗階段的TILs 免疫治療研究

3.2.1 前列腺癌的TILs 免疫治療體外實驗 前列腺癌是西方國家和地區(qū)的男性最常見的惡性腫瘤。Yunger 等[2]從8 例前列腺癌患者的腫瘤標本中提取并擴增了自體TILs，發(fā)現(xiàn)其T 細胞亞群組成、分化狀態(tài)和共抑制/刺激性標志物在表型上具有特征，TILs與自體腫瘤的體外共培養(yǎng)實驗證明其具有抗腫瘤作用。這些發(fā)現(xiàn)表明盡管腫瘤具有免疫抑制性微環(huán)境，但仍可獲得功能性和抗腫瘤反應性TILs，因此TILs 免疫治療用于前列腺癌患者具有非常好的前景。

3.2.2 膀胱癌的TILs 免疫治療體外實驗 Aydin 等[3]對53 例膀胱癌患者進行隊列研究，69.8%（37/53）的腫瘤組織中存在TILs，在含有IL-2 的培養(yǎng)基中加入活化的4-1BB 抗體可擴增經卡介苗治療后膀胱癌TILs的數量，74.3%（26/35）的TILs 具有抗腫瘤活性，提示TILs 免疫治療用于膀胱癌是一種可行的治療方法。

3.3 處于臨床試驗階段的TILs 免疫治療

3.3.1 肺癌的TILs 免疫治療 肺癌主要分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌，其中NSCLC 包括腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等組織學類型。Kradin 等[4]將自體腫瘤組織培養(yǎng)的TILs 過繼回輸給7 例轉移性晚期肺腺癌患者，結果5例患者轉移病灶明顯縮小。Ben-Avi 等[5]從5 例NSCLC 患者的手術切除腫瘤標本中成功分離出多種TILs 培養(yǎng)物，這可能為轉移性NSCLC 患者提供一種新的治療方式。

3.3.2 惡性黑色素瘤的TILs 免疫治療 Rosenberg等[6]用IL-2 激活的TILs 聯(lián)合IL-2、環(huán)磷酰胺治療20 例晚期黑色素瘤患者取得較好效果，約50%的患者轉移病灶部分或全部消退。隨后，Rosenberg 等[7]又用自體TILs 聯(lián)合IL-2 治療93 例黑色素瘤患者，20例腫瘤完全消退，19 例腫瘤在3年后持續(xù)完全消退，患者3年和5年生存率分別為36%和29%。TILs 免疫療法治療黑色素瘤取得的顯著成效鼓舞了廣泛性研究，不斷地優(yōu)化該治療體系。此外，冷凍保存的TILs產品Lifileucel（LN-144）用于治療黑色素瘤的試驗取得了積極的結果。

3.3.3 乳腺癌的TILs 免疫治療 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。根據2019年的St.Gallen 國際共識[8]，采用免疫組織化學替代基因表達譜分析可將浸潤性乳腺癌分為四個分子亞型：Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2 過表達型和三陰型。Zacharakis 等[9]報道了1 例化療無效、激素受體陽性的轉移性乳腺癌患者，接受TILs 免疫治療后病灶完全消失。這是TILs 免疫療法首次成功應用于晚期乳腺癌，此結果表明自體TILs 免疫療法是治療乳腺癌患者的可行選擇。

3.3.4 結直腸癌的TILs 免疫治療 Baek 等[10]從結直腸癌患者提取TILs，并證明離體擴增的TILs 主要包含效應T 細胞，能引發(fā)抗腫瘤反應。Tran 等[11]從1 例肺轉移性結直腸癌患者的病灶中提取并發(fā)現(xiàn)存在KRAS 突變的多克隆CD8+T 細胞，體外擴增后將其重新回輸患者，觀察到7 處肺轉移灶中有6 處完全消失。

3.3.5 肝癌的TILs 免疫治療 肝癌具有惡性程度高、死亡率高、進展快、復發(fā)快、轉移快的特點。Jiang 等[12]報道15 例原發(fā)性肝癌患者在腫瘤切除后用活化和擴增的TILs 進行過繼細胞治療，經過14 個月隨訪后有12 例患者無疾病進展跡象。這一結果表明TILs 免疫療法為肝癌患者提供了一種新的治療方法。

3.4 經FDA 批準的TILs 免疫治療

Stevanovi?等[13]對接受過鉑類化療或放化療無效的9 例轉移性宮頸癌患者給予單次輸注TILs 治療，結果顯示：3 例患者產生客觀的腫瘤反應，其中2 例完全緩解。此外，LN-145 療法（基于自體TILs 免疫療法）初步試驗結果表明，前期接受過化療或放化療均無效的27 例復發(fā)或轉移性的宮頸癌患者的客觀緩解率（objective response rate，ORR）達44%，完全緩解率（complete remission rate，CRR）達11%?；诖伺R床試驗的驚艷數據，F(xiàn)AD 批準LN-145 療法用于晚期宮頸癌的突破性治療，并加速其上市審批。

4 TILs 判斷腫瘤患者預后的研究進展

經過大量的研究表明，TILs 在腫瘤中的數量和亞群組成對于實體瘤患者預后判斷具有重要價值。

4.1 TILs 數量與腫瘤患者預后的關系

Day 等[14]報道表明，中-重度TILs 浸潤的皮膚黑色素瘤患者的預后明顯優(yōu)于無或輕度TILs 浸潤的患者。Radosevic-Robin 等[15]發(fā)現(xiàn)TILs 密度≥50%能顯著提高三陰型和HER-2 過表達型乳腺癌對新輔助治療的反應和總生存（overall survival，OS）率，TILs 密度可以預測新輔助治療的療效和患者的預后。有研究報道[16]發(fā)現(xiàn)低TILs 與胃癌患者淋巴結轉移存在顯著相關，且為淋巴結轉移存在的獨立預測因子，TILs 數量是預測早期胃癌預后和選擇合適治療的重要因素。

4.2 TILs 亞群組成與腫瘤患者預后的關系

4.2.1 CD3+、CD4+和CD8+T 細胞是有利預后因素 在TILs 亞群中CD4+T 細胞和CD8+T 細胞是主要的效應細胞。Fu 等[17]報道CD3+、CD4+和CD8+T 細胞浸潤是黑色素瘤患者OS 的有利預后因素，其中CD8+T細胞在黑色素瘤患者OS 的預后價值更高。Gao 等[18]報道CD4+和CD8+T 細胞是三陰型乳腺癌患者長期預后良好的預測指標。

4.2.2 CD19+和CD20+B 細胞是有利預后因素 在TILs 亞群中，B 細胞介導體液抗腫瘤免疫。Lin 等[19]通過酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼治療108 例轉移性腎細胞癌，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在CD19+B 細胞的患者無病生存（disease-free survival，DFS）率和OS 更長，對舒尼替尼的治療反應更好，并且與CD8+T 細胞呈正相關，顯示腫瘤組織中B 細胞密度不僅是轉移性腎細胞癌患者的獨立預后因素，也是TKIs 治療的預測標志。Helmink 等[20]分析了轉移性黑色素瘤和腎細胞癌隊列腫瘤組織中的免疫細胞組成，發(fā)現(xiàn)B 細胞和三級淋巴結構與患者對腫瘤免疫治療的反應呈正相關；CD8+T 細胞和CD20+B 細胞同時出現(xiàn)，預測患者有更高的生存率；三級淋巴結構在黑色素瘤的免疫微環(huán)境中起關鍵作用。Cabrita 等[21]通過RNA 測序對比免疫療法起效和無效的黑色素瘤，發(fā)現(xiàn)B 細胞標志物是兩類腫瘤中表達差異最明顯的基因；腫瘤組織中CD8+T 細胞和CD20+B 細胞同時存在與更好的OS 相關；三級淋巴結構的形成對維持T 細胞功能起重要作用，并與對免疫檢查點抑制劑治療的反應呈正相關。

4.2.3 CD204+M2 型Mφ、CCR4+和FOXP3+Treg 細胞是預后不良因素 在TILs 亞群中，Mφ、Treg 細胞也可作為預后因子。Kawachi 等[22]分析148 例宮頸腺癌，發(fā)現(xiàn)CD204+M2 型Mφ 高度浸潤與患者較短的DFS 顯著相關，是宮頸腺癌患者預后的不良因素。Watanabe 等[23]分析CCR4+Treg 細胞在15 例前列腺癌根治術和60 例前列腺癌穿刺活檢標本中的浸潤情況，發(fā)現(xiàn)CCR4+Tregs 細胞在預后較差患者的前列腺癌組織中高度浸潤，這些患者可能發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌。Liu 等[24]研究發(fā)現(xiàn)FOXP3+Treg 細胞在進展期胃癌原發(fā)灶中的浸潤明顯高于肝轉移灶；其在原發(fā)灶和轉移灶的輕度浸潤的患者預后較好，提示FOXP3+Tregs 細胞可作為胃癌患者的不良預后因素。

5 結語

自體TILs 作為效應細胞，其殺傷腫瘤細胞作用強，目前TILs 免疫治療在大多實體瘤中都取得了不錯的療效。Kodumudi 等[25]報道聯(lián)合抗PD-L1 治療和過繼體外擴增的TILs 能顯著抑制小鼠動物模型腫瘤的生長，阻斷共抑制免疫檢查點是改善TILs 浸潤和功能的有效策略。然而在實際臨床治療中還存在著一些問題： 1）TILs 成分多樣，其擴增回輸之前應進行抗原檢測以及分選；2）回輸的TILs 對腫瘤細胞應該有特定的殺傷效應，這樣才有助于療效的提高；3）TILs 在體外大量擴增需要時間和成本，將其推廣應用于臨床較為困難，應該對整個擴增流程制定一個統(tǒng)一的行業(yè)標準。基于上述問題，將TILs 應用到臨床中還需要進行不斷地實驗與探索，改良擴增方法和聯(lián)合治療都是未來研究發(fā)展的趨勢。