劉寶山 張輝 徐又佳

蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科、骨質(zhì)疏松臨床中心 蘇州大學(xué)骨質(zhì)疏松癥診療技術(shù)研究所，江蘇 蘇州215004

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種增齡性骨代謝疾病，其特征是骨密度降低，骨骼脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[1-3]。骨質(zhì)疏松癥主要在50歲以后女性和65歲以后男性中多見(jiàn)[2]；但是，也有研究認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥與多種危險(xiǎn)因素和遺傳因素密切相關(guān)，不過(guò)目前仍缺乏有效的預(yù)測(cè)和預(yù)防方法[4]。蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能的效應(yīng)者，與疾病表型的關(guān)系比基因或轉(zhuǎn)錄更密切；蛋白組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，研究細(xì)胞、組織或生物個(gè)體蛋白質(zhì)組成及其變化的規(guī)律。因此，蛋白組學(xué)對(duì)于識(shí)別疾病新的診斷和治療靶點(diǎn)或監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展具有重要作用[5]。

1 生物學(xué)標(biāo)志物和蛋白組學(xué)

生物學(xué)標(biāo)志物是生物體受到嚴(yán)重?fù)p害之前，在系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平發(fā)生改變的信號(hào)指示物。它可以是細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)和功能變化，也可以是某一生化代謝過(guò)程變化。通過(guò)對(duì)生物學(xué)標(biāo)志物的測(cè)定可了解機(jī)體當(dāng)下所處的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)疾病預(yù)防、早期診斷和治療具有積極意義[6]。

蛋白質(zhì)組學(xué)正被眾多學(xué)科應(yīng)用，它可以檢測(cè)正?；蚣膊顟B(tài)下組織全部表達(dá)蛋白質(zhì)在量上的差別。早期最常用的是雙向電泳技術(shù)，后來(lái)發(fā)展出的非凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)包括了質(zhì)譜分析(mass spectrometry，MS)、高效液相色譜分析(high performance liquid chromatography, HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用以及蛋白芯片等[7]。與基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)相比，蛋白組學(xué)在識(shí)別病理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)失調(diào)的蛋白和通路更高效，有助于發(fā)現(xiàn)疾病特異性突變和表觀遺傳學(xué)改變[8]，這也使得蛋白組學(xué)成為獲取生物學(xué)標(biāo)志物的重要技術(shù)手段。2020年權(quán)威期刊《NATURE REVIEWS GENETICS》發(fā)表綜述，認(rèn)為對(duì)人體細(xì)胞、組織和體液的“蛋白質(zhì)組學(xué)分析”可為探究人類復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程提供有價(jià)值的參考，非常有助于理解遺傳和非遺傳因素如何影響著疾病的結(jié)局，從而揭示與疾病相關(guān)的生物學(xué)途徑和生物學(xué)標(biāo)志物，獲得疾病新的藥物靶點(diǎn)[7]。

2 骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域人體蛋白組學(xué)研究

為了深入研究骨密度的分子決定因素，許多學(xué)者開(kāi)展了蛋白組學(xué)研究，對(duì)骨相關(guān)細(xì)胞或組織中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類篩選，以確定與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)，從而獲得診斷骨質(zhì)疏松癥或預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松骨折的生物學(xué)標(biāo)志物。

2.1 單核細(xì)胞蛋白組學(xué)

主要是指從外周血中分離出單核細(xì)胞進(jìn)行蛋白組學(xué)分析以鑒定骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。由于在骨密度峰值期(即絕經(jīng)前，20～45歲)，女性骨代謝處于骨形成和骨吸收的相對(duì)平衡狀態(tài)，為探索不同個(gè)體之間骨密度差異的內(nèi)在遺傳因素提供了一個(gè)獨(dú)特的“窗口期”。因此，2008年Deng等[9]從1 000名中國(guó)絕經(jīng)前女性中篩選出30名具有極高和極低髖部骨密度的受試者，采集分離外周血單核細(xì)胞，通過(guò)蛋白組學(xué)方法獲得38個(gè)差異表達(dá)蛋白。其中，超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(GPX1)在骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)分別顯著上調(diào)和下調(diào)；由于SOD2可催化超氧化物生成過(guò)氧化氫(H2O2)，而GPX1可保護(hù)H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷，是人體最重要的抗氧化酶之一，作者提出SOD2和GPX1可能共同作用于細(xì)胞，調(diào)節(jié)H2O2水平。之前有研究表明，H2O2可以刺激破骨細(xì)胞分化，并增強(qiáng)成熟破骨細(xì)胞活性[10]。此外，在RAW 264.7細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)GPX可抑制其向破骨細(xì)胞分化和形成[11]。因此，Deng等在低骨密度組中檢測(cè)到的SOD2上調(diào)和GPX1下調(diào)可能促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、形成和活性，在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

Deng等[12-13]針對(duì)絕經(jīng)前白人婦女的研究結(jié)果顯示膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)和凝溶膠蛋白(GSN)在低骨密度受試者的外周單核細(xì)胞中分別顯著上調(diào)和下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)表明，ANXA2可顯著促進(jìn)單核細(xì)胞跨內(nèi)皮屏障的遷移，在低骨密度受試者中ANXA2表達(dá)水平升高，可能會(huì)刺激更多的單核細(xì)胞在體內(nèi)通過(guò)血管壁遷移到骨表面，從而促進(jìn)單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化以及骨吸收，導(dǎo)致骨密度降低[13]。另外，Deng等認(rèn)為GSN可能通過(guò)與雄激素受體(AR)相互作用，增強(qiáng)雄激素誘導(dǎo)的AR反式激活，從而抑制單核細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)單核細(xì)胞凋亡，減少破骨細(xì)胞的形成和骨吸收，增加骨密度[12,14]。2015年Daswani等[15]研究發(fā)現(xiàn)與RANKL相關(guān)的熱休克蛋白27(HSP27)在絕經(jīng)前和絕經(jīng)后低骨密度婦女的單核細(xì)胞中均明顯上調(diào)；與上述ANXA2研究類似，HSP27體外實(shí)驗(yàn)也提示HSP27可促進(jìn)單核細(xì)胞的遷移，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和骨吸收。綜上所述，ANXA2、GSN和HSP27有可能作為骨質(zhì)疏松癥的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。2017年Zeng等[16]建立了第一個(gè)人單核細(xì)胞蛋白組學(xué)庫(kù)，共包含2 237個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，也將為單核細(xì)胞生物學(xué)與骨質(zhì)疏松癥的深入研究提供了參考。

2.2 血清、血漿蛋白組學(xué)

主要是指用蛋白組學(xué)的方法直接從血漿或血清中鑒定相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物。Ozgocmen等[17]研究提示患有骨質(zhì)疏松癥的絕經(jīng)后女性的血漿中SOD酶活性顯著高于非骨質(zhì)疏松癥組；此外，一些生活質(zhì)量評(píng)分，如疼痛、精神和社會(huì)功能與SOD酶活性也相關(guān)。因此，SOD可能是絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的重要指標(biāo)。Zhou等[3]研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)老年人血漿中ANXA2蛋白水平與髖部骨密度呈負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)表明，ANXA2以濃度依賴方式調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞hFOB1.19生長(zhǎng)，其在較低濃度時(shí)可促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，而在較高濃度時(shí)促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)作用減弱，這就解釋了在低骨密度者中觀察到血漿ANXA2水平升高的現(xiàn)象。當(dāng)然，血漿ANXA2蛋白水平是否能預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)疏松骨折還有待于進(jìn)一步研究。

Bhattacharyya等[18]研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女血清中的間α胰蛋白酶抑制劑重鏈H4(ITIH4)可使破骨細(xì)胞活性增加，導(dǎo)致骨密度降低，骨折風(fēng)險(xiǎn)升高。目前，臨床研究中預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松性骨折的血清生物學(xué)標(biāo)記物主要是通過(guò)橫斷面研究確定，但也有少部分從前瞻性研究中確定。Arasu等[19]發(fā)表了一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究，結(jié)果顯示在老年女性中，血清硬化素(sclerostin)水平越高，髖部骨折風(fēng)險(xiǎn)越大?，F(xiàn)在，硬化素抗體Evenity(romosozumab)已被FDA批準(zhǔn)上市，用于治療絕經(jīng)后伴隨有高骨折風(fēng)險(xiǎn)的骨質(zhì)疏松癥。

2.3 外泌體蛋白組學(xué)

主要是指從骨相關(guān)細(xì)胞及其微環(huán)境各種組分中分離出外泌體以鑒定相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物。近年來(lái)，外泌體蛋白組學(xué)受到越來(lái)越多的關(guān)注，其中也包括骨相關(guān)細(xì)胞來(lái)源的外泌體[20-21]。2015年Ge等[20]從小鼠來(lái)源MC3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離出微囊泡，用蛋白質(zhì)譜的方法鑒定了外泌體含量以及潛在的成骨相關(guān)蛋白和通路。結(jié)果顯示，外泌體主要來(lái)源于細(xì)胞質(zhì)膜，主要參與蛋白質(zhì)定位和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且真核細(xì)胞起始因子2通路在成骨過(guò)程中起著重要的作用。2018年Xie等[22]對(duì)老年骨質(zhì)疏松癥或骨量減少患者和正常志愿者血清中純化的外泌體進(jìn)行了定量蛋白組學(xué)分析，共鑒定了1 371種蛋白。后續(xù)生物信息學(xué)分析和體外研究表明，骨質(zhì)疏松癥患者血清來(lái)源外泌體中蛋白的變化不僅參與了抑制整合素介導(dǎo)的成骨細(xì)胞的機(jī)械感受和激活，還觸發(fā)了破骨細(xì)胞分化和吸收；相反，骨量減少患者的血清來(lái)源的外泌體既促進(jìn)了破骨細(xì)胞激活又促進(jìn)了新骨形成，這可能導(dǎo)致骨重塑代償性升高；而老年正常志愿者的血清來(lái)源的外泌體可能通過(guò)抑制衰老相關(guān)的氧化應(yīng)激而對(duì)骨健康起到保護(hù)作用。2020年還有類似研究發(fā)表，Chen等[23]應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較了骨質(zhì)疏松癥患者、骨量減少患者和骨量正常者血漿外泌體的蛋白表達(dá)，共鑒定了45個(gè)差異蛋白；其中4個(gè)，PSMB9，AARS，PCBP2和VSIR得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

PSMB9是一種蛋白酶復(fù)合體，一些基礎(chǔ)研究已經(jīng)揭示了蛋白酶體在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性調(diào)節(jié)中的重要作用。Garrett等[24]研究發(fā)現(xiàn)，抑制蛋白酶體的特定催化β亞基可以通過(guò)增強(qiáng)成骨細(xì)胞的功能和增加成骨細(xì)胞的數(shù)量來(lái)促進(jìn)體外和體內(nèi)的骨形成。Chandra等[25]研究提示一種用于治療多發(fā)性骨髓瘤的蛋白酶體抑制劑Bortezomib可能在治療放射性骨質(zhì)疏松癥方面起作用。其余3種蛋白尚未有報(bào)道它們與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)。PCBP2已被證明與RNA結(jié)合蛋白K相互作用，后者主要參與破骨細(xì)胞形成，調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)[26]。VSIR是一種免疫調(diào)節(jié)受體，可抑制BMP4信號(hào)，而B(niǎo)MP4參與骨骼和軟骨的發(fā)育，特別是四肢的發(fā)育和骨折的修復(fù)[27]。AARS可能導(dǎo)致肌肉無(wú)力和萎縮，但沒(méi)有證據(jù)表明AARS對(duì)骨量有影響[28]。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松的病理機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供了參考。

2.4 骨組織蛋白組學(xué)

主要是直接從骨骼組織中鑒定相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。骨組織樣本往往參雜了造血干細(xì)胞、基質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，由此獲得的組學(xué)結(jié)果反映了一個(gè)復(fù)合的細(xì)胞環(huán)境，其中，骨細(xì)胞占95 %以上。因此，骨組織蛋白組學(xué)結(jié)果仍具有較強(qiáng)的說(shuō)服力[29]。2011年Alves等[30]從4個(gè)行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者獲得健康松質(zhì)骨片段，然后用質(zhì)譜的方法進(jìn)行骨組織蛋白組學(xué)分析，產(chǎn)生了一個(gè)包含3 038種蛋白的文庫(kù)。該文庫(kù)不僅含有大多數(shù)經(jīng)典骨基質(zhì)蛋白，還包含了一些具有未知功能蛋白，是骨質(zhì)疏松癥等骨相關(guān)疾病生物學(xué)標(biāo)志物的來(lái)源。2012年Chaput等[31]用質(zhì)譜的方法，對(duì)比患骨關(guān)節(jié)炎伴有骨量減少和患骨關(guān)節(jié)炎但骨量正常的患者股骨中蛋白質(zhì)表達(dá)差異。結(jié)果表明，在骨量減少情況下，碳酸酐酶I(CA1)和磷酸甘油酸激酶1(PGK1)增加，而載脂蛋白A-1(apoA-1)減少。綜上所述，骨組織蛋白組學(xué)能反映在骨質(zhì)疏松癥與非骨質(zhì)疏松癥人群骨骼中直接執(zhí)行功能的差異蛋白，為尋找直接干預(yù)的藥物靶點(diǎn)提供了全新角度。

3 動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域蛋白組學(xué)研究

由于倫理原因，利用組學(xué)研究人體骨重塑過(guò)程還是受到一定限制。此外，人體研究可能會(huì)受到許多混雜因素的影響，如飲食和生活方式，這些因素幾乎不可能被控制，而且在樣本可獲得性方面也可能存在限制，動(dòng)物模型規(guī)避了上述問(wèn)題。當(dāng)然，動(dòng)物模型不一定能完全模擬人類疾病生物學(xué)過(guò)程，比如在骨代謝研究時(shí)我們需要考慮動(dòng)物與人體在骨骼新陳代謝和成分上的差異。

目前，骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的動(dòng)物骨組織蛋白組學(xué)研究很少。2005年Fan等[32]通過(guò)建立去勢(shì)雌性大鼠(OVX)模型研究雌激素缺乏對(duì)大鼠骨骼蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果鑒定出三種不同的蛋白質(zhì)與骨質(zhì)疏松相關(guān)，分別為硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶1(TPX1)、肌球蛋白輕肽2(MYL2)和泛素綴合酶E2-17kD(UBE2D2)。同年，Pastorelli等[33]一項(xiàng)針對(duì)小鼠的研究表明，與細(xì)胞骨架和能量通路相關(guān)的蛋白可能是骨組織中重要的雌激素調(diào)節(jié)蛋白，在骨代謝中起到重要作用。2009年Huang等[34]發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)大鼠相比，OVX大鼠骨組織非膠原蛋白減少。2017年Calciolari等[35-36]首次評(píng)估了正常和OVX大鼠在不同階段骨形成過(guò)程中的蛋白質(zhì)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E(ApoE)和載脂蛋白A-IV(Apo A-Ⅳ)在OVX大鼠中都顯著高表達(dá)；此外，凝膠電泳和質(zhì)譜結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)炎癥和應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。

4 小結(jié)

蛋白質(zhì)可通過(guò)轉(zhuǎn)錄剪接、翻譯后修飾等機(jī)制產(chǎn)生多種產(chǎn)物，對(duì)生物生理和病理功能產(chǎn)生直接影響。因此，鑒定在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起主要作用的蛋白質(zhì)對(duì)明確機(jī)制和完善治療具有重要意義。蛋白組學(xué)主要通過(guò)檢測(cè)遺傳位點(diǎn)在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化，來(lái)尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì)與疾病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)，以期更準(zhǔn)確地推測(cè)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)。現(xiàn)有證據(jù)表明，蛋白組學(xué)為骨質(zhì)疏松癥機(jī)制研究開(kāi)拓了全新思路，為尋找可靠的早期診斷、療效和預(yù)后評(píng)價(jià)的生物學(xué)標(biāo)志物提供了依據(jù)。但是，目前通過(guò)蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)的骨質(zhì)疏松癥相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物尚未被轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床。因此，未來(lái)的研究不僅要致力于探索骨質(zhì)疏松癥特異性生物學(xué)標(biāo)志物，還應(yīng)對(duì)已證實(shí)的生物學(xué)標(biāo)志物及可能治療骨質(zhì)疏松癥的藥物進(jìn)行進(jìn)一步探索效驗(yàn)。從而使蛋白組學(xué)技術(shù)真正在臨床發(fā)揮作用。此外，骨質(zhì)疏松癥相關(guān)組學(xué)研究現(xiàn)在正朝著多組學(xué)融合的方向發(fā)展，以期更好地理解復(fù)雜生理病理機(jī)制，其最終目標(biāo)是根據(jù)每一位患者的需要量身定制治療方案來(lái)改善骨質(zhì)疏松癥的結(jié)局。