朱 亮 林享玉 何 晶

（同濟大學醫(yī)學院病理和病理生理學系，上海 200092）

皮膚作為人體最大的器官，是隔離外界環(huán)境的天然屏障。燒傷感染、外科手術(shù)及放射性損傷等都可導(dǎo)致皮膚損傷[1]。尤其是大面積皮膚缺損，雖然臨床上多采取自體皮膚移植，但供體來源不足及二次損傷等都限制了其應(yīng)用，而同種異體移植又面臨免疫排斥而難以獲得更好療效。干細胞技術(shù)和組織工程的飛速發(fā)展，為組織器官損傷修復(fù)、重構(gòu)再生提供了更具優(yōu)勢的新途徑，成為再生醫(yī)學領(lǐng)域最具潛力的發(fā)展方向之一，也為大面積皮膚缺損的治療提供了新思路[2]。種子細胞是皮膚組織工程的關(guān)鍵要素之一，而干細胞因增殖能力強、多向分化潛能被認為是理想的種子細胞來源。干細胞包括胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）和成體干細胞等，其中ESCs 存在倫理學方面的爭議，而iPSCs涉及安全性、效率和再分化機制等方面的問題，目前均難以用于臨床；成體干細胞是從成體組織中獲得，例如脂肪干細胞（adipose tissue-derived stem cells，ASCs）、骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）、牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）等，近年來在再生醫(yī)學領(lǐng)域開展了大量的研究[3]。其中，ASCs是2001年Zuk等[4]首次從脂肪組織中提取，其具有來源豐富、損傷小、獲得量大、增殖能力強且免疫原性低等獨特優(yōu)勢，被認為是組織工程理想的種子細胞之一。現(xiàn)主要從ASCs的獲取培養(yǎng)、生物學特性及其在皮膚再生及組織工程中的應(yīng)用及相關(guān)研究進展展開論述。

1 ASCs的獲取和體外培養(yǎng)

1.1 ASCs的獲取、分離

ASCs多通過腹部或臀部等部位抽脂、吸脂術(shù)獲取。無論是人或者動物，ASCs分離方法和其他間充質(zhì)干細胞類似，均可通過酶消化法或者非酶促分離法來獲得。酶消化法最為常用，主要通過膠原酶消化細胞間的膠原組織，使細胞彼此分離，再經(jīng)過過濾、洗滌和離心等操作等后獲得單細胞狀態(tài)的ASCs，速度快，但成本稍高。而非酶促分離法包括組織塊貼壁法、梯度離心法等。組織塊貼壁法存在細胞貼壁難，漂浮在液體中容易在換液過程中丟失；而梯度離心雖然操作簡單，但仍有損失大、獲得量有限的問題，因此非酶促分離法在實踐中較少采用。

1.2 ASCs的純化

脂肪屬于中胚層，類似于骨髓擁有豐富的基質(zhì)，包含有多種組織成分。酶消化法所獲得的是一個混雜的細胞群，又稱為血管基質(zhì)部分（stromal vascular fraction，SVF）。SVF除了具有多向分化能力的ASCs，還含有分化在不同階段的脂肪系細胞，如成熟的脂肪細胞、前脂肪細胞及脂肪祖細胞等，另外還包括成纖維細胞、周細胞、內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞、血管平滑肌細胞、免疫細胞和造血干細胞等多種細胞成分[5-6]。有研究顯示，ASCs作為SVF的干性成分，實際上主要分布在白色脂肪組織中血管周圍[7]。而通常人ASCs可通過多次傳代培養(yǎng)，逐漸提高ASCs的純度，干細胞表面標志鑒定顯示純度可達95%以上。也有學者通過免疫磁珠或流式分選等方法進一步純化ASCs。

1.3 ASCs的體外培養(yǎng)

ASCs的培養(yǎng)方式、培養(yǎng)體系及氧濃度[8]等均是影響ASCs體外培養(yǎng)的重要因素。相較于傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)，3D培養(yǎng)方式可以促進細胞增殖和特異性蛋白表達[9]。而無血清培養(yǎng)液可以增強ASCs增殖能力，有效減小其倍增時間，并促進其向脂肪和骨的方向分化[10]。低氧環(huán)境不但促進ASCs增殖及干性維持[11]，也促進多種可溶性因子的合成和分泌[12]，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF），同時有利于血管化[13]。

2 ASCs的生物學特性

2.1 ASCs的分化能力

與BMSCs相似，ASCs在特定的誘導(dǎo)條件下具有分化為脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、尿路上皮細胞、心肌細胞等的多向分化能力[14-16]。而與BMSCs相較，ASCs具有損傷小、獲得量大及異位骨化可能性小的獨特優(yōu)勢，使其在臨床治療的應(yīng)用中具有更大的潛力。同時，供者年齡、組織類型、取材部位、手術(shù)方式、培養(yǎng)條件及細胞密度等都可能影響到ASCs的活力、增殖和多向分化能力。

2.2 ASCs的分泌功能

ASCs具有強大的分泌功能，例如其可分泌多種血管生長因子，包括VEGF、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管生成素等，有助于血管內(nèi)皮化及微血管形成。ASCs還可合成及分泌白細胞介素（interleukin，IL）類、集落刺激因子類、干擾素類、趨化因子類等多種生物活性物質(zhì)[17]，參與脂代謝、食欲及胰島素敏感性等的調(diào)節(jié)。同時，ASCs分泌如外泌體等細胞外囊泡，囊泡內(nèi)帶有大量蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)分子等生物活性物質(zhì)，參與到周圍細胞發(fā)育和功能的調(diào)節(jié)中[18]。

2.3 ASCs的細胞表型

目前分離獲取的ASCs經(jīng)過體外傳代培養(yǎng)后可獲得純化，其細胞表面可表達特征性受體和黏附分子[19]。與其他成體間充質(zhì)干細胞的表型類似，ASCs具有如CD73、CD90、CD105等多種間充質(zhì)干細胞的特異性表面抗原[20]。

3 ASCs在皮膚組織工程及再生中的應(yīng)用

3.1 促進皮膚創(chuàng)面愈合

3.1.1 調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)促進修復(fù) ASCs在創(chuàng)面炎癥初期遷移至局部創(chuàng)面部位發(fā)揮重要作用[21]。有研究表明，ASCs促進炎癥局部血管生成和上皮細胞增殖再生，同時通過促進巨噬細胞等炎性細胞及內(nèi)皮祖細胞的遷移，從而促使局部創(chuàng)面成纖維細胞增殖遷移和肉芽組織增生調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，該作用相比于BMSCs更具優(yōu)勢[22]。ASCs分泌多種生長因子調(diào)控成纖維細胞和內(nèi)皮祖細胞等的生長、分化，促進血管化和膠原合成，為局部創(chuàng)面修復(fù)奠定基礎(chǔ)。另外，分泌含有蛋白、脂質(zhì)和RNA等的外泌體也是ASCs參與創(chuàng)面組織的修復(fù)和再生的重要作用機制。Li等[23]的研究顯示過表達Nrf2的ASCs分泌的外泌體可以有效下調(diào)局部創(chuàng)面IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等參與炎癥反應(yīng)相關(guān)細胞因子的水平，從而有效抑制炎癥反應(yīng)，輔助創(chuàng)面修復(fù)。

3.1.2 ASCs促進一般創(chuàng)面愈合 創(chuàng)面愈合是一個涉及上皮形成、新生血管生成以及膠原沉積，并伴有炎癥反應(yīng)的復(fù)雜生理過程，其關(guān)鍵因素是局部炎性細胞釋放的細胞因子和新血管形成的數(shù)量。研究表明，ASCs可通過分泌多種生物因子促進纖維化，旁分泌相關(guān)細胞因子加速血管內(nèi)皮細胞的增殖和血管化[24]，同時ASCs可以減少α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和I型膠原的含量，改善真皮組織空間結(jié)構(gòu)，從而有效抑制創(chuàng)面愈合過程中的瘢痕形成[25-26]。黃敏等[27]將ASCs聯(lián)合富血小板纖維蛋白復(fù)合物用于治療小鼠全層皮膚缺損，結(jié)果顯示可顯著提高創(chuàng)面愈合率，并抑制炎癥反應(yīng)。

3.1.3 促進難愈性創(chuàng)面愈合 而臨床上一些年老體弱、極度營養(yǎng)不良患者，或者某些具有基礎(chǔ)疾病的患者，其皮膚創(chuàng)面的愈合往往非常困難，例如糖尿病足部創(chuàng)面愈合、放射性損傷皮膚創(chuàng)面等。趙月強等[28]通過自體ASCs局部注射的治療方法，顯示實驗組創(chuàng)面愈合面積顯著高于對照組，創(chuàng)面感染率和平均住院時間顯著低于對照組。這主要依賴于ASCs通過增殖分化為不同類型的組織細胞及分泌VEGF、bFGF等促進成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞的遷移，增加局部毛細血管和側(cè)支循環(huán)來促進皮膚愈合[29-30]。另外，Horton等[31]報道ASCs能夠通過下調(diào)IL-1等促炎因子、增加IL-4等抗炎因子的分泌調(diào)節(jié)免疫細胞的數(shù)量和功能，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，這對放射性損傷引起的難愈性創(chuàng)面具有良好的治療效果[32]。同時ASCs還可以直接分化為表皮細胞，上述生物因子也可促進表皮角化細胞的增殖和遷移，從而加速創(chuàng)面的再上皮化[33]。

3.2 抑制瘢痕疙瘩

瘢痕形成是創(chuàng)面愈合的自然過程，病理性瘢痕是膠原沉積和重塑異常導(dǎo)致真皮細胞外基質(zhì)產(chǎn)生過多及降解不足從而形成的，尤其瘢痕疙瘩是皮膚損傷愈合后所形成的過度生長的病理性瘢痕[34]。瘢痕會給患者帶來疼痛、痙攣及功能障礙等，影響患者身心健康。ASCs可以有效降低成纖維細胞和肥大細胞的活性，從而調(diào)節(jié)膠原沉積，刺激血管再生，可在治療瘢痕疙瘩中發(fā)揮作用[35]。

有研究表明，異常瘢痕形成與TGF-β1/Smad信號通路密切相關(guān)[36]。Penn等[37]將ASCs和成纖維細胞共培養(yǎng)，顯示ASCs可以顯著降低該通路中的轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、磷酸化Smad2/3以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白等關(guān)鍵成分，防止TGF-β1刺激成纖維細胞從而降低其增殖能力，可以有效抑制瘢痕形成。李響等[38]通過共培養(yǎng)ASCs與瘢痕疙瘩成纖維細胞，24 h后檢測成纖維細胞相關(guān)指標，結(jié)果顯示ASCs可以顯著抑制成纖維細胞的增殖、遷移和膠原合成能力，并且作用效果可隨ASCs的比例升高而增強。同時，ASCs還可以有效降低病理性瘢痕中成纖維細胞的侵襲性，抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，促進成纖維細胞凋亡。Li等[39]報道ASCs可通過P38/MAPK信號通路促進α-SMA陽性的成纖維細胞數(shù)量凋亡及磷酸化p38下調(diào)，從而降低膠原沉積，減小瘢痕形成。

3.3 ASCs參與構(gòu)建組織工程化皮膚

ASCs具有多向分化潛能，例如直接分化為脂肪細胞而填充組織；分化為內(nèi)皮細胞等促進新生血管形成，為移植組織提供營養(yǎng)，提高成活率；并且可旁分泌VEGF、HGF等多種細胞因子，促進周圍組織修復(fù)再生[40]。而新興支架材料等[41]輔助新技術(shù)的出現(xiàn)進一步提高了ASCs促進皮膚創(chuàng)面愈合的能力，而且也為其在皮膚組織工程的應(yīng)用提供新的可能。支架材料可為ASCs的增殖和分化提供適宜的微環(huán)境，從而顯著提高創(chuàng)面修復(fù)效果、減少瘢痕增生。Machula等[42]以電紡絲彈性蛋白原作為ASCs的遞送載體以評價其在小鼠皮膚切口模型中的傷口愈合效果，顯示ASCs處理組與對照組相比，傷口閉合速度和上皮厚度顯著改善。Wang等[43]以基于多肽的FHE水凝膠（F127/OHA-EPL）作為支架材料結(jié)合ASCs外泌體修復(fù)大鼠皮膚損傷創(chuàng)面，與對照組相比，顯著加快了創(chuàng)面愈合。Zonari等[44]在3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物（PHBV）結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)ASCs，并將其移植到小鼠背側(cè)全層損傷模型中，與對照組相比，PHBV組的VEGF、bFGF和血管密度表達較高。這提示新生血管的形成，并可通過減少TGF-β1和α-SMA，上調(diào)TGF-β3的表達，從而修復(fù)皮膚缺損，減少傷口疤痕。

ASCs因可增殖分化為皮膚創(chuàng)面修復(fù)所需要的各種細胞，以及通過旁分泌作用分泌VEGF等各種生物活性物質(zhì)的能力，從而調(diào)控參與皮膚修復(fù)的各種生理機能。因此，ASCs被認為是修復(fù)皮膚損傷及構(gòu)建組織工程皮膚重要的細胞來源，不但在燒傷、慢性難愈性創(chuàng)面等諸多疾病的治療領(lǐng)域取得了一定的成效，并且其作為種子細胞聯(lián)合新型生物材料構(gòu)建組織工程化皮膚，用于將來的大面積皮膚缺損修復(fù)也具有明顯優(yōu)勢。但其向皮膚組織定向分化的誘導(dǎo)方案尚不完善，以及ASCs的混雜性等，都是ASCs應(yīng)用于再生研究及臨床轉(zhuǎn)化的難題，有待進一步研究。