王蘭林 綜述，戚仁莉，余化霖 審校

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院微創(chuàng)神經外科，云南 昆明 650000)

膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)中最常見惡性腫瘤。在成人致死性腦腫瘤中，高級別膠質瘤最多，其生長迅速、細胞豐富、有明顯的色差和多形性，即使確診后積極治療，包括手術最大限度切除病灶、術后放化療等綜合治療措施，療效仍不盡人意。膠質瘤患者平均生存時間僅為12～14個月，長期存活比例很低(<5%)[1]，其原因是膠質瘤細胞呈侵襲性生長及生物學特征異質性導致。科學家們?yōu)榇诉M行了大量基礎與臨床研究，而細胞培養(yǎng)技術是基礎研究的基礎。

二維細胞培養(yǎng)技術成熟，具有經濟、操作簡便等優(yōu)點，一直以來是腫瘤生物學研究體外實驗的重要方法，但也存在不能反映腫瘤體內真實生長情況等不足。自20世紀中期有人提出三維細胞培養(yǎng)(3DCC)這一概念以來，經過數十年發(fā)展，三維體外模型彌補了二維細胞培養(yǎng)與整個動物系統(tǒng)之間的空白。通過模仿體內環(huán)境特征，三維模型為干細胞的行為、發(fā)育中的組織和器官及腫瘤的行為提供了獨特視角，有助于加速癌癥生物學和組織工程學的轉化研究。

1 3DCC概念

3DCC是指將具有三維結構的不同材料載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng),使細胞與周圍環(huán)境中的細胞外基質(ECM)、各種細胞因子、化學因子、物理因子及其他細胞發(fā)生交流與相互作用，進而在三維立體空間結構中遷移、生長,構成三維的細胞-載體復合物[2]。相比于二維細胞培養(yǎng)技術，3DCC既可模擬細胞體內生長的微環(huán)境，還同時具有體外細胞實驗的直觀性和條件可控性等優(yōu)勢。3DCC因體外模型與腫瘤體內生長環(huán)境具有相似的形態(tài)學和細胞生物學特性，現已廣泛應用于腫瘤學研究。

三維培養(yǎng)膠質瘤細胞在形態(tài)學、增殖速度、細胞周期等方面與二維培養(yǎng)細胞有明顯差異,并且具有類似體內高級別膠質瘤的免疫組化特點,三維膠原復合支架能更好地模擬體內膠質瘤生長的微環(huán)境,可作為膠質瘤體外模型，并用于多種研究[3]。與現有的源自患者的細胞培養(yǎng)方法相比，膠質母細胞瘤(GBM)的三維培養(yǎng)支架提供了更好的生理表現和異種移植模型[4]。

2 3DCC在膠質瘤細胞培養(yǎng)中的應用

2.1抗腫瘤藥物耐藥性或新的抗腫瘤藥物篩選方面 傳統(tǒng)的體外研究方法是將細胞培養(yǎng)為單層細胞或神經球細胞(富含癌癥干細胞的細胞簇)，但這兩種方法都不能準確反映GBM三維化學耐受微環(huán)境的復雜性。三維微腫瘤是一種多功能的高通量模型系統(tǒng)，比傳統(tǒng)方法更能在體內復制腫瘤生物學[5]。使用三維細胞模型評價藥物的耐藥性有利于得到更加準確的結果，從而為體內實驗提供更可靠的參考[6]。MUSAH-EROJE等[7]研究發(fā)現，與二維細胞培養(yǎng)技術相比，三維培養(yǎng)細胞對替莫唑胺的耐藥性更強，而缺氧則增強了這種耐藥。研究結果表明，微環(huán)境因素影響GBM對替莫唑胺的敏感性。因此，了解三維模型中涉及替莫唑胺耐藥的機制可能有助于確定新的策略，從而更有效地使用現有的藥物標準。有學者提出了一種新穎的三維水凝膠平臺VersaGel，其可以使患者或患者衍生的異種移植物模型在離體組織中生長，并在臨床相關的時間范圍內評估對批準的療法(如替莫唑胺)的敏感性，這在轉化研究和個性化醫(yī)學中將非常有用[8]。

KAPHLE等[9]研究指出，在二維或三維培養(yǎng)環(huán)境中，藥理分子對腫瘤細胞運動的作用不同。也有學者建立了用于三維膠質瘤細胞培養(yǎng)的膠原支架，在這些三維支架上培養(yǎng)的膠質瘤細胞比二維培養(yǎng)細胞表現出更大程度的去分化和靜止。三維培養(yǎng)細胞對化療藥物烷基化劑的耐受性也增強了，使膠質瘤干細胞的比例大大增加，并且上調O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶。而且，三維培養(yǎng)腫瘤細胞顯示出與膠質瘤患者相似的化療耐藥模式。這表明三維膠原支架在體外篩選新的抗膠質瘤藥物的研究平臺是有希望的[10]。MA等[11]建立了三維體外腫瘤模型，并證明其是了解GBM內在本質的有力工具，可以被視為潛在的藥物篩選平臺。KESSEL等[12]開發(fā)了實時動態(tài)半胱氨酸蛋白酶3/7凋亡和碘化丙啶三維多細胞腫瘤球活性測定，這兩種方法均可用于二級篩選，以更好地了解從一級篩選中識別出的這些潛在候選藥物的作用機制，從而可以鑒定出更合格的候選藥物并簡化藥物的發(fā)現過程、研究與開發(fā)。BERNARDO等[13]利用3DCC篩選出LQB-118。該藥物是用于GBM單藥治療并與放療或順鉑相關的有希望的藥物，其作用與抑制GBM相關的生存信號通路有關。

2.2腫瘤血管生成方面 近年來，抗血管生成療法一直是神經腫瘤學的主要研究重點和熱點。血管生成在腫瘤生長和存活中起重要作用，為抗癌治療提供了靶標。GBM是最具侵襲性和血管化的腫瘤之一，貝伐單抗被認為是使GBM患者受益最多的抗血管生成藥物。到目前為止，沒有一種藥物能超過貝伐單抗的治療益處。此外，抗血管生成藥物的抗?jié)B透作用可以顯著減少腫瘤相關的水腫，從而能夠穩(wěn)定或改善患者神經功能和生活質量。特別是，抗血管生成劑可顯著延長患者無進展生存期[14]。KO等[15]介紹了一種注塑成型的塑料陣列三維球體培養(yǎng)平臺，其可用于研究腫瘤球體誘導的血管生成模型，有潛力提供與血管化癌癥研究相關的強大且可重復的體外測定。這個易于使用、隨時可用的平臺可以轉化為增強的臨床前模型，可以忠實地反映復雜的腫瘤微環(huán)境。

有學者利用3DCC模擬體內血管生成的三維空間，真實有效地評估各因素對血管生成的影響。該研究以膠質瘤球體和纖維蛋白凝膠中的人類臍靜脈內皮細胞作為腫瘤模型，觀察阿托伐他汀對GBM細胞的抗血管生成和凋亡活性，結果發(fā)現，這種具有纖維蛋白的仿生模型可以提供廣泛適用的三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以研究阿托伐他汀等抗癌藥對體內和體外腫瘤惡性的影響，并且阿托伐他汀可以用作GBM的治療藥物[16]。

2.3膠質瘤細胞基因表達和生物學功能方面 目前，3DCC已越來越多地用于研究腫瘤細胞生物學，以改進對自然發(fā)育環(huán)境的模擬。STOCZYNSKA-FIDELUS等[17]結合免疫細胞化學、酶細胞化學、5-溴脫氧尿嘧啶核苷摻入法和實時顯微鏡觀察異檸檬酸脫氫酶1(IDH1) R132H突變的8種膠質瘤細胞培養(yǎng)物中的衰老特征，結果發(fā)現，3DCC可延長腫瘤IDH1 R132H陽性細胞的存活，但是并不能提高穩(wěn)定效率。提示膠質瘤細胞的衰老是在體外自動觸發(fā)的，為基于這種現象的潛在新治療策略提供了機會。

有研究使用具有不同大小空隙的三維膠原蛋白支架與傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng),用于基因表達譜的比較和相關的神經膠質瘤細胞的生理功能研究，包括U87 U251 HS683細胞系。該研究結果顯示，三維膠原支架培養(yǎng)可上調與干性、細胞周期、凋亡、上皮-間充質轉化、遷移、侵襲和膠質瘤惡性相關基因的表達，并誘導相應的功能改變；膠原支架的孔徑大小似乎不影響膠質瘤細胞的基因表達或功能。提示三維膠原支架增強了膠質瘤細胞的惡性程度，可作為膠質瘤研究的體外研究平臺[18]。

與二維細胞培養(yǎng)技術相比，三維培養(yǎng)腫瘤細胞顯示出對細胞毒性T細胞介導的免疫反應的抵抗力增強。然而，三維培養(yǎng)腫瘤細胞是否具有增強的對NK細胞毒性的抗性，目前尚不清楚。有研究者通過比較蛋白質組學在二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的U251細胞之間的363個差異表達蛋白，并通過生物學信息構建了基于這些差異蛋白的免疫相關蛋白-蛋白相互作用網絡，結果顯示，三維培養(yǎng)細胞中人類白細胞抗原-E的上調可能導致腫瘤對NK細胞介導的免疫反應的抵抗力增強[19]。

GBM的侵襲和遷移、滲透到非腫瘤腦實質是導致目前治療困難的關鍵生物學行為。而HUANG等[20]應用三維水凝膠模型研究發(fā)現，Rac1和RhoA信號的聯合抑制將是抑制GBM入侵的有前途的策略，為GBM的侵襲和遷移研究提供了方向。DIAO等[21]的研究在微型三維模型中培養(yǎng)了4種類型的典型GBM細胞系(LN229、SNB19、U87、U251),結果顯示，GBM細胞在細胞形態(tài)、增殖、遷移和侵襲方面顯示出特定的特性，其中一些很少見。此外，該研究詳細觀察了細胞如何侵入周圍的ECM及相應的特定侵襲模式。提示這4種類型的細胞在其癌癥發(fā)展過程中具有不同特征。如果將這種復雜的體外模型應用于患者衍生的細胞，則具有成為臨床相關預測模型的潛力。

2.4腫瘤細胞對輻射敏感性方面 放射治療已成為高級別膠質瘤術后常規(guī)治療手段，其利用高能射線(X線、重粒子等)破壞腫瘤細胞DNA雙鏈結構，殺傷、殺死腫瘤細胞[22]。放射治療是否有效取決于膠質瘤細胞對射線的敏感性，CARAGHER等[23]總結和分析了3DCC系統(tǒng)的發(fā)展，并特別關注了其如何加強化合物的設計和識別，從而提高放療的療效。JIGUET-JIGLAIRE等[24]對U87-MG GBM細胞和人GBM的7種原代細胞培養(yǎng)物進行放療和化療，結果顯示，三維水凝膠保留了原始的癌癥生長行為，并能夠評估惡性神經膠質瘤對放射線和藥物的敏感性，以反映治療反應的腫瘤間異質性。因此，該方法可以用于新療法的臨床前評估。

CHIBLAK等[25]研究了不同CD133狀態(tài)的膠質瘤干細胞在光子、質子和碳照射后的三維模型中的輻射敏感性，結果發(fā)現，碳輻照在消除膠質瘤干細胞中是有效的，其相對生物學效應范圍大約為2～3。該研究數據強烈建議使用經典的放射生物學端點進一步探索膠質瘤干細胞。GOMEZ-ROMAN[26]等建立的GBM三維模型能夠可靠地預測臨床療效，在GBM藥物放射聯合治療的臨床前評估中的具有潛在價值。隨后從3DCC模型中獲得的數據確定了GBM中DNA修復和放射敏感性的新決定因素和機制，以及血管內皮生長因子/蛋白激酶B(Akt)信號傳導通過調節(jié)非同源末端連接與同源重組介導的DNA修復之間的平衡來影響放射敏感性的新作用，并確認Akt是有希望的治療靶標[27]。

2.5膠質瘤干細胞方面 目前缺乏支持臨床侵襲性的GBM干細胞生長的體外模型，阻礙了針對GBM的新型有效療法的開發(fā)。雖然原位癌患者來源的GBM異種移植模型可以最好地反映體內腫瘤行為，但建立異種移植耗時、昂貴且成功率較低。為了解決這些限制，合成了由多殼聚糖和透明質酸組成的三維多孔支架，并直接從生長在支架上或附著單層細胞的新鮮異種植物中獲取GBM干細胞，對其細胞表型生長、表達進行比較。雖然二維貼壁培養(yǎng)物為扁平上皮細胞的單層生長，但GBM細胞以自黏卵形細胞簇的形式在透明質酸支架孔內增殖。支架上的生長伴隨著基因的更高表達，這些基因介導上皮-間質轉化并維持原始的、未分化的表型，這是腫瘤干細胞的標志。支架生長的細胞還顯示出更高的基因表達，這些基因促進了對低氧誘導的氧化應激的抗性。與貼壁細胞相比，支架生長的細胞對臨床利用的烷基化劑表現出明顯的抗性。提示三維透明質酸支架能更好地模仿體內生物學和臨床行為，并為開發(fā)新型的個性化治療提供了依據[28]。WANG等[29]將神經膠質瘤細胞系與三維透明質酸支架一起培養(yǎng)，以探索神經膠質瘤干細胞樣細胞富集的可能性，結果顯示，三維透明質酸支架具有更好的富集膠質瘤干細胞樣細胞的能力，可以作為一種簡單有效的體外培養(yǎng)和富集腫瘤干細胞的方法，以支持腫瘤干細胞生物學研究和新型抗癌療法的發(fā)展。

3 小 結

3DCC作為一項新技術，近年來在腫瘤研究領域成為熱門話題，但其仍存在很多不足，有待進一步改善和發(fā)展。一方面，3DCC費用高、對操作技術要求高、操作過程較復雜、用時長；另一方面，培養(yǎng)環(huán)境與人體真實狀態(tài)存在差異，尚不能完全模擬體內環(huán)境，而且由于模型中心缺乏營養(yǎng)或供氧，細胞無法無限生長。隨著3DCC技術與材料學、生命科學等技術的交叉融合和不斷發(fā)展，這些不足都會逐步解決，其在腫瘤領域的研究具有廣闊的前景和價值。相信隨著3DCC的發(fā)展，新的時期、新的領域將會產生新的研究成果，使膠質瘤的治療邁上新的臺階，最終造福廣大患者。