徐健，李曉東，孫明強(qiáng)，何小華，高振忠

[1.濰坊醫(yī)學(xué)院婦幼保健院（濰坊市婦幼保健院），山東 濰坊261011；2.武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430071]

熱性驚厥在嬰兒和兒童中很常見，約占2%，是兒童最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。根據(jù)美國兒科學(xué)會(huì)的定義，熱性驚厥是一種無代謝異?；蝻B內(nèi)感染，與發(fā)熱性疾病相關(guān)的驚厥，可分為單純型驚厥和復(fù)雜型驚厥[2]，與體溫達(dá)39℃或更高有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，急性電解質(zhì)失衡、發(fā)育遲緩、病毒感染、有發(fā)燒痙攣家族史[3-4]，以及鐵、鋅的缺乏可能是導(dǎo)致熱性驚厥的潛在危險(xiǎn)因素[5]。臨床研究表明，單純退熱治療對(duì)預(yù)防熱性驚厥復(fù)發(fā)無效，與苯巴比妥聯(lián)合使用可有效預(yù)防熱性驚厥的復(fù)發(fā)[6]。由于這些藥物潛在的毒性已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了兒童熱性驚厥造成的危害，因此迫切需要尋找更多新的生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)、診斷和治療熱性驚厥。

近年來，隨著對(duì)非編碼RNA 的深入研究，microRNA（miRNA）在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，尤其是與大腦發(fā)育的關(guān)系越來越受到重視[7-9]。miRNA屬于一個(gè)非編碼的微小RNA 家族，是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可以抑制mRNA 翻譯或直接降解靶mRNA[10]。miRNA 對(duì)神經(jīng)元的正常發(fā)育至關(guān)重要，與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，其機(jī)制仍有待研究。例如miRNA 在涉及大腦發(fā)育和成人神經(jīng)可塑性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用[9]。miR-124a 和miR-9 能夠調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的分化[11]，而腦特異性miR-9 在調(diào)節(jié)干細(xì)胞衍生的神經(jīng)前體細(xì)胞的細(xì)胞行為中起關(guān)鍵作用。miRNA 作為一種表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式，在驚厥、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮非常重要的作用。

本研究首先通過經(jīng)典熱水浴誘導(dǎo)驚厥的方法復(fù)制反復(fù)熱性驚厥大鼠模型。隨后利用大鼠miRNA表達(dá)譜芯片比較分析大鼠發(fā)育期反復(fù)熱性驚厥后海馬和健康大鼠海馬中差異表達(dá)的miRNA，并采用多種生物信息學(xué)方法如分級(jí)聚類分析、功能分類、基因網(wǎng)絡(luò)分析、靶基因預(yù)測(cè)分析等對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘和分析，以獲取大量生物信息。這些候選的易感miRNA 及潛在的芯片數(shù)據(jù)信息對(duì)研究熱性驚厥的發(fā)病機(jī)制及其與癲癇的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系具有重要的作用，為發(fā)現(xiàn)新的熱性驚厥臨床分子生物靶標(biāo)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 反復(fù)熱性驚厥模型的復(fù)制

選取10 只SPF 級(jí)14 d日齡健康SD 大鼠，通過經(jīng)典熱水浴誘導(dǎo)驚厥，復(fù)制熱性驚厥動(dòng)物模型，連續(xù)熱水浴7 d，按照熱性驚厥的5 級(jí)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]，選取熱性驚厥行為綜合評(píng)分最高的3 只SD 大鼠進(jìn)行miRNA 表達(dá)譜基因芯片分析，同時(shí)選取3只健康SD 大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2014-0012；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2014-0067。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 miRNA 表達(dá)譜基因芯片將兩組大鼠海馬組織樣本送至上?？党苫蚬荆凑瞻步輦恗iRNA 表達(dá)譜芯片（大鼠）標(biāo)準(zhǔn)化操作流程進(jìn)行芯片分析。

1.2.2 差異表達(dá)miRNA的篩選從miRNA 表達(dá)譜基因芯片中獲得標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，首先以隨機(jī)方差模型和Limma 算法作為差異鑒別方法，以P<0.05，F(xiàn)C>1.5 為差異基因標(biāo)準(zhǔn)，篩選出兩組間存在差異表達(dá)的miRNA。

1.2.3 miRNA靶基因預(yù)測(cè)成熟的miRNA 序列均來 自miRBase（http://www.mirbase.org）。分別利用TargetScan（http://www.targetscan.org）和miRDB（http://www.mirdb.org）2 個(gè)在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miRNA 的潛在靶基因，并取兩者的交集作為最終候選靶基因。

1.2.4 差異表達(dá)miRNA 靶基因的生物信息分析通過生物信息學(xué)對(duì)上述篩選的候選靶基因進(jìn)行GO 功能注釋分析。通過計(jì)算其P值（Fisher 確切概率法）、富集分?jǐn)?shù)，可獲得顯著富集的GO 類別。通過GO 功能分析可聚焦具有顯著差異的功能集群，篩選并鑒定感興趣的靶基因與何種基因功能相關(guān)[13]。通過聯(lián)合KEGG 等多種數(shù)據(jù)庫，利用Fisher 精確概率法對(duì)候選靶基因的Pathway 進(jìn)行顯著性富集分析。通過信號(hào)通路分析可以篩選及鑒定候選靶基因所參與的Pathway，進(jìn)而研究靶基因與哪些細(xì)胞信號(hào)通路的改變相關(guān)。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析是利用STRING 數(shù)據(jù)庫結(jié)合Cytoscape 軟件分析miR-148a-3p 靶基因（蛋白）之間的相互作用關(guān)系。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù)采用qRT-PCR 驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA。通過提取海馬組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以此為模板。根據(jù)miRNA 序列設(shè)計(jì)PCR引物，并檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量；按照Qiagen 試劑盒說明書進(jìn)行操作。選取U6基因?yàn)閮?nèi)參基因。根據(jù)公式2-△△Ct=[Ct（target）-Ct（U6）]A-[Ct（target）-Ct（U6）]B，計(jì)算miRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本差異分析用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNA聚類分析

分級(jí)聚類主要根據(jù)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的相似性，利用Pearson 相關(guān)系數(shù)作為相似性度量，最后將個(gè)體樣本進(jìn)行集群分析。經(jīng)過分級(jí)聚類分析，所有實(shí)驗(yàn)樣本被分為2 個(gè)主要的不同集群，符合筆者預(yù)期的實(shí)驗(yàn)分組結(jié)果。以P<0.05，F(xiàn)C >1.5 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得31個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中包括21個(gè)上調(diào)miRNA 和10 個(gè)下調(diào)miRNA（見圖1A）。

2.2 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA

為進(jìn)一步證實(shí)基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)挑選9 個(gè)差異表達(dá)miRNA。結(jié)果顯示，qRT-PCR 的驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片的結(jié)果相符，證明基因芯片數(shù)據(jù)可靠（見圖1B）。

圖1 差異表達(dá)miRNA熱圖和qRT-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.3 差異表達(dá)miRNA的靶基因GO功能和Path‐way分析

為進(jìn)一步分析篩選得到的差異表達(dá)miRNA 的靶基因的GO 功能，利用miRNA 靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 預(yù)測(cè)出3 247 個(gè)交集靶基因。利用生物信息學(xué)方法對(duì)靶基因進(jìn)行GO 功能分類。以P<0.01 為閾值，獲得顯著差異的GO 功能集群，主要包括基因轉(zhuǎn)錄、神經(jīng)元分化、大腦及海馬發(fā)育等。見圖2。

圖2 31個(gè)差異表達(dá)miRNA的GO功能分析

同時(shí)，以P<0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)差異表達(dá)基因參與的顯著性Pathway 進(jìn)行分析。獲得具有顯著差異的TOP 10 信號(hào)通路，主要包括：顯著富集的Pathway 主要包括癌癥相關(guān)、FoxO信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、多巴胺突觸通路等，這些信號(hào)通路均與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。見圖3。

圖3 31個(gè)差異表達(dá)miRNA信號(hào)通路分析

2.4 miR-148a-3p靶基因預(yù)測(cè)分析

根據(jù)生物信息及文獻(xiàn)檢索分析，筆者選定miR-148a-3p 作為候選易感miRNA 進(jìn)行后續(xù)研究。首先通過miRNA 靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)篩選，共獲得186個(gè)靶基因，其中120 個(gè)靶基因（紅色）參與神經(jīng)、免疫、表觀遺傳等功能，其是驚厥、癲癇等的重要影響因素。見圖4。

2.5 miR-148a-3p靶基因GO功能和Pathway分析

為進(jìn)一步分析篩選得到的miR-148a-3p 靶基因的GO 功能，利用miRNA 靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 共預(yù)測(cè)186 個(gè)交集靶基因（見圖4）。結(jié)合AmiGO 多個(gè)數(shù)據(jù)庫的信息對(duì)186 個(gè)靶基因進(jìn)行GO 功能分析。以P<0.05 為閾值，獲得具有顯著差異GO 功能分類，包括神經(jīng)元生成及分化、大腦發(fā)育、轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合、組蛋白修飾等多種與神經(jīng)、免疫及表觀遺傳相關(guān)的功能，這些因素與驚厥及癲癇有著非常密切的聯(lián)系（見圖5A～C）。

圖4 miR-148a-3p靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

同時(shí)，以P<0.05 為閾值，對(duì)186 個(gè)靶基因所參與的顯著性Pathway 進(jìn)行分析，獲得具有顯著差異的TOP 10 信號(hào)通路，主要包括：FoxO信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路都與驚厥和癲癇疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。見圖5D。

2.6 miR-148a-3p 靶基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

通常情況下，基因不是單獨(dú)起作用，而是多個(gè)基因形成相互作用的復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)從而控制機(jī)體的生物進(jìn)程。為進(jìn)一步探索靶基因之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，筆者選取186 個(gè)交集靶基因，利用STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因蛋白相互作用分析，結(jié)果表明分子網(wǎng)絡(luò)中紅顏色的基因（Ube2d1、Ube2d2、Ube3b、Skp1、Fbxl19、Ccnf、Smurf2）位于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的中心，被認(rèn)為是在該網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵調(diào)控作用的基因。見圖6。

2.7 miR-148a-3p的靶基因NCOA1

通過生物信息分析及文獻(xiàn)搜索，筆者發(fā)現(xiàn)NCOA1的功能與神經(jīng)、免疫系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系，因此確定NCOA1作為候選靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，NCOA1基因上存在miR-148a-3P 的靶基因作用位點(diǎn)（見圖7）。通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證NCOA1是否為miR-148a-3p 的真正靶基因。將構(gòu)建成功的WT-pGL3-NCOA13'-UTR 載 體、MUT-pGL3-NCOA13'-UTR 載體，分別與miRNA-148a-3p mimics或?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，48 h 后檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、miR-148a-3p mimics 組、共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性分別為（0.96±0.01）、（0.13±0.00）、（0.98±0.10），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=224.899，P=0.000）。與對(duì)照組比較，miR-148a-3p mimics 組和共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性受到抑制（P<0.05），而miR-148a-3p mimics 組與共轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-148a-3p 與NCOA1的靶位點(diǎn)共同存在時(shí)，才能抑制熒光素酶基因表達(dá)，將靶位點(diǎn)部分堿基突變后，則不能發(fā)揮抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明NCOA1是miR-148a-3p 作用的靶基因，下一步可進(jìn)行其功能機(jī)制的研究。

圖5 miR-148a-3p預(yù)測(cè)靶基因的GO功能和Pathway分析

圖6 miR-148a-3p 靶基因蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖

圖7 TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)靶基因位點(diǎn)示意圖

3 討論

熱性驚厥在0～5 歲幼兒和兒童中常見，多種因素可能會(huì)增加熱性驚厥風(fēng)險(xiǎn)[10]。不同種類的miRNA 在大腦中表達(dá)，并在驚厥及癲癇等神經(jīng)疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中miR-148a-3p 參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡，且參與多種類型的癌癥、自身免疫性疾病、炎癥疾病及其他病理過程。鑒于以上原因，本研究利用miRNA 表達(dá)譜基因芯片技術(shù)，探討miRNA 在熱性驚厥中的作用機(jī)制，以期更好地研究熱性驚厥的病理機(jī)制。

本研究首先復(fù)制熱性驚厥大鼠模型，利用miRNA 表達(dá)譜基因芯片技術(shù)對(duì)驚厥和健康大鼠海馬組織miRNA 表達(dá)進(jìn)行深入分析。根據(jù)分級(jí)聚類分析的結(jié)果，6 組實(shí)驗(yàn)樣本被分成2 個(gè)不同集群，由此可推斷出實(shí)驗(yàn)樣本分類是可靠的，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)過信息分析，獲得31個(gè)差異表達(dá)miRNA 及相關(guān)的功能信息。21 個(gè)miRNA 顯著上調(diào)，包括miR-542-5p、miR-499-5p、miR-148a-3p、miR-451-5p。11個(gè)miRNA顯著下調(diào)，其中以miR-207、miR-130b-3p下調(diào)最為顯著。這些差異表達(dá)miRNA 是否參與熱性驚厥的發(fā)生、發(fā)展過程需要進(jìn)一步研究。同時(shí)，為驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性，選取10 個(gè)差異表達(dá)miRNA，利用qRT-PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與芯片結(jié)果相符，為后續(xù)表達(dá)譜基因芯片的分析提供可靠的基礎(chǔ)。

隨后，經(jīng)過信息綜合分析發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p 在海馬組織的表達(dá)水平升高，與qRT-PCR 結(jié)果一致，因此選取miR-148a-3p 進(jìn)行深入研究和分析。差異表達(dá)miR-148a-3p 的功能與神經(jīng)免疫、細(xì)胞凋亡都有密切聯(lián)系。最新研究表明，在缺血性腦卒中疾病中，miR-148a-3p 可以與lncRNA-h19和ROCK2基因形成作用路徑，進(jìn)而調(diào)節(jié)由于缺血性腦卒中造成的氧化應(yīng)激[14]。另外，miR-148a-3p 可以靶向KLF6基因，調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞的增殖和凋亡[15]。miR-148a 作為miR-148a-3p 的前體，與其有著同樣的活性，并且可以調(diào)控多種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的蛋白因子。在帕金森和阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，miR-148a 的表達(dá)存在顯著異常。生物信息分析篩選獲得的其他差異表達(dá)的miRNA 也值得去研究，其功能都與神經(jīng)免疫等因素有緊密的聯(lián)系。研究表明，在缺血缺氧性腦病中，miR-499-5p可以通過調(diào)節(jié)C 反應(yīng)蛋白的表達(dá)水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16]。miR-207 可能參與了OSA 誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙。另外，miR-130b-3p 可以抑制eCIRP 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[17]。

筆者通過TargetScan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-148a-3p 的靶基因，獲得交集靶基因186 個(gè)。利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息構(gòu)建靶基因關(guān)系圖。在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中發(fā)現(xiàn)KLF6基因被證實(shí)是miR-148a-3p 的靶基因，并且可以促進(jìn)神經(jīng)元的軸突再生[18]。同時(shí),在預(yù)測(cè)的靶基因中，發(fā)現(xiàn)多個(gè)靶基因與神經(jīng)免疫功能密切相關(guān)。例如，NCOA1、NOG、NPTN等。NCOA1又名SRC-1，可以影響大鼠海馬突觸可塑性和空間學(xué)習(xí)記憶能力，并且可以影響下丘腦神經(jīng)元的功能。隨后筆者通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NCOA1是miR-148a-3p 調(diào)節(jié)的靶基因。另有研究發(fā)現(xiàn)，基因NOG拮抗劑可以恢復(fù)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量和神經(jīng)生成，同時(shí)可以促進(jìn)髓鞘的修復(fù)[19]。Neuronplastin（NPTN）作為一種多功能的神經(jīng)元黏附分子，與長時(shí)程的突觸可塑性密切相關(guān)[20]。

選取miR-148a-3p 的186 個(gè)候選靶基因進(jìn)行GO功能和Pathway 分析。分析結(jié)果提示熱性驚厥與神經(jīng)免疫炎癥關(guān)系密切，為研究免疫炎癥在熱性驚厥中的作用提供了重要線索。例如，顯著GO 功能包括神經(jīng)元分化、大腦發(fā)育、突觸發(fā)生等。在差異顯著Pathway 中，F(xiàn)oxO信號(hào)通路存在顯著差異。在癲癇狀態(tài)下，通過激活FoxO信號(hào)通路可引起驚厥誘導(dǎo)的神經(jīng)元的死亡[21]。同時(shí)，F(xiàn)oxO信號(hào)通路家族可以參與多種病理?xiàng)l件下的細(xì)胞死亡[22]。FoxO1和FoxO2在免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化中起重要作用。FoxO1和FoxO3可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的形成，抑制Th1 和Th17 細(xì)胞的形成[23]。

最新研究表明，miRNA 與神經(jīng)系統(tǒng)疾病中海馬神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)[24-25]。miR-223 表達(dá)上調(diào)可以抑制驚厥大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡和大腦損傷[26]。miR-421 可以通過TLR 受體信號(hào)通路進(jìn)而抑制癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡[27]。沉默miR-134 可以減輕癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元損傷及自發(fā)驚厥頻率[28]。另有研究表明，miR-148a-3p 與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。miR-148a-3p 與DNMT1 形成調(diào)控路徑，促進(jìn)腫瘤的增生[29]。另有研究表明，在急性胰腺炎疾病中，miR-148a-3p 可以通過靶向PTEN 來抑制細(xì)胞壞死[30]。上調(diào)miR-210-3p 可以抑制缺氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡[31]。miR-34a 抑制劑可以通過Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[32]。在前面的研究中，課題組采用miRNA 表達(dá)譜芯片及qRT-PCR證實(shí)大鼠發(fā)育期反復(fù)驚厥后海馬miR-148a-3p 顯著上調(diào)，提示miR-148a-3p 可能參與驚厥的發(fā)生、發(fā)展。其可能通過分析結(jié)果中預(yù)測(cè)的某個(gè)靶基因或者信號(hào)通路參與驚厥的發(fā)生、發(fā)展過程。

綜上所述，本研究通過對(duì)反復(fù)驚厥大鼠海馬miRNA 表達(dá)譜基因芯片進(jìn)行分析，獲得一系列的差異表達(dá)miRNA 和候選預(yù)測(cè)靶基因的GO 及Pathway等相關(guān)信息。這些豐富的數(shù)據(jù)對(duì)于后期研究熱性驚厥的發(fā)病機(jī)制起重要的提示作用，為發(fā)現(xiàn)新的熱性驚厥臨床分子靶標(biāo)提供有利的證據(jù)。