鄧悅寧，周達(dá)岸，王卓，馬賢德

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州121000；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 沈陽(yáng)110847）

隨著交通事故與高空墜落事件的逐年增多，以兩者為主要發(fā)病原因的疾病——脊髓損傷（spinal cord injury, SCI）在全球的發(fā)病率由1995年的10.4～83.0/100 萬(wàn)[1]增 長(zhǎng) 到2018年 的87.2～136.9/100 萬(wàn)[2]，其損傷嚴(yán)重程度以美國(guó)脊髓損傷協(xié)會(huì)（ASIA）標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)為A 級(jí)居多，即完全性SCI。完全性SCI 中約80%以上的患者為完全性骶上脊髓損傷（sacral spinal cord injury, SSCI），是臨床中最常見(jiàn)的脊髓損傷節(jié)段[3]。并發(fā)各種程度的括約肌和反射功能障礙，損傷平面以下運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能完全喪失。完全性SSCI 后骶髓排尿中樞失去腦橋排尿中樞的抑制，逼尿肌無(wú)抑制反復(fù)收縮，形成神經(jīng)源性膀胱（neurogenic bladder, NB）逼尿肌反射亢進(jìn)，晚期形成腎衰竭危及生命。

電針治療完全性SSCI 后NB 的臨床療效及安全性已得到高度的認(rèn)可[4-5]，其治療的作用機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。耿鑫[6]研究發(fā)現(xiàn)電針通過(guò)調(diào)控Notch 信號(hào)通路能夠促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并抑制內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。脊髓室管膜區(qū)和白質(zhì)普遍存在內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞[7]，其激活后可增殖、分化為神經(jīng)細(xì)胞，修復(fù)神經(jīng)功能[8-9]。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在神經(jīng)修復(fù)中發(fā)揮重要作用[10]。本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)電針通過(guò)促進(jìn)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中Wnt-1 和β-catenin 關(guān)鍵蛋白在脊髓組織中的表達(dá)來(lái)改善模型大鼠排尿功能[11]。基于前期的研究結(jié)果，本文繼續(xù)探討電針治療完全性SSCI 后NB 大鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SD雌性大鼠60只，6～8周齡，體重（210±10）g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2016-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（遼）2019-0004。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組12 只，模型組48 只。在室溫23℃、濕度50%、通風(fēng)良好的環(huán)境下飼養(yǎng)7 d，鼠籠墊料更換1 次/2 d，食水自由。實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)大鼠的處置方式符合中華人民共和國(guó)科技部2006年發(fā)布《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2 主要儀器和試劑

電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特公司），Sanyo 超低溫冰箱（日本Sanyo 公司），全自動(dòng)脫水機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、展片機(jī)、包埋機(jī)、烤片機(jī)（德國(guó)Leica 公司），VE-180 雙垂直電泳槽、4200 SF 凝膠成像分析系統(tǒng)、ESP 300 電泳儀（上海天能科技有限公司），DM 2000 數(shù)碼顯微鏡（德國(guó)徠卡公司），SHA-B 恒溫振蕩器（常州國(guó)華電器有限公司），WD-9405B 脫色搖床（北京市六一儀器廠），Bio-Rad 型PCR 儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），BL-420 S 16 通道生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），SDZ-Ⅲ電針治療儀、華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽(yáng)有限公司），CyclinD1 抗體（Ab 16663）、Neurogenin 1 抗體（Ab 66498）、β-actin抗體（Ab 8227）（英國(guó)Abcam 公司），二抗、SP 試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），蛋白提取試劑盒（P0013）、蛋白定量試劑盒（P0010S）、SDSPAGE 凝膠試劑盒（P0012A）、蛋白marker（P0068）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），SP 試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司）。

1.3 模型復(fù)制方法

采取手術(shù)方式復(fù)制完全性SSCI 大鼠模型。1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)，脊柱背側(cè)胸椎下段備皮，碘伏消毒，解剖定位T10椎體，以T10棘突為中心沿背側(cè)正中線切開(kāi)皮膚，切口長(zhǎng)約2 cm，然后向下逐層分離皮下組織，沿椎板鈍性分離豎脊肌，暴露T9～T11棘突和椎板。手術(shù)刀切開(kāi)T9、T10的棘間韌帶，咬骨鉗自T9、T10椎板間隙緊貼椎板平行脊髓進(jìn)鉗，輕輕咬除椎板，直至咬除整個(gè)T10椎板及兩側(cè)的關(guān)節(jié)突。咬骨過(guò)程中，注意保護(hù)脊髓硬脊膜、血管和神經(jīng)根。用彎頭眼科鑷挑起脊髓，于脊髓上緣橫向切斷脊髓，反復(fù)切割脊髓3～5 次。此時(shí)可見(jiàn)大鼠雙下肢抽搐，尾巴甩動(dòng)并松弛，提示脊髓完全橫斷。用明膠海綿充分止血并填充內(nèi)縮形成的空洞，逐層縫合。假手術(shù)組暴露T9～T11，并用咬骨鉗去除T10棘突，然后逐層縫合。

1.4 模型評(píng)價(jià)

術(shù)后待大鼠完全清醒，采用BBB 評(píng)分評(píng)價(jià)各組大鼠脊髓橫斷情況[12]。評(píng)分由0～21 分組成，0 分為無(wú)可見(jiàn)雙后肢運(yùn)動(dòng)，分?jǐn)?shù)越高則大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能越好，21 分為持續(xù)狀態(tài)的掌面移動(dòng)、協(xié)調(diào)步態(tài)、足趾抓地、軀干穩(wěn)定、尾巴翹起，活動(dòng)過(guò)程中身體與主動(dòng)爪位置始終處于平行狀態(tài)。3人采用單盲法記錄評(píng)價(jià)結(jié)果并整理分析。大鼠完全性SSCI 后雙后肢呈拖動(dòng)前行狀態(tài)，無(wú)任何運(yùn)動(dòng)為0分，表明大鼠脊髓橫斷模型復(fù)制成功。術(shù)后大鼠正常飼養(yǎng)，模型組大鼠每日手法排尿，記錄尿量。連續(xù)2 周后，大鼠排尿量穩(wěn)定，測(cè)定假手術(shù)組和模型組大鼠的尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，評(píng)估完全性SSCI后NB 大鼠模型情況。

1.5 干預(yù)

模型復(fù)制后大鼠正常飼養(yǎng)至第2 周結(jié)束，將模型復(fù)制成功的大鼠再次隨機(jī)分為模型對(duì)照組、電針組、電針對(duì)照組，每組12 只。

4 組大鼠干預(yù)因素如下：假手術(shù)組不作處理，正常飼養(yǎng)7 d。模型對(duì)照組，再次分組后不作處理，正常飼養(yǎng)7 d。電針組以0.3 mm×25.0 mm 毫針直刺，連接電針儀，正極連接大椎穴，負(fù)極連接次髎穴，電針儀參數(shù)設(shè)定為疏密波，10/50 Hz（疏波10 Hz/9 s，密波50 Hz/5 s），留針20 min，強(qiáng)度以針刺處出現(xiàn)規(guī)律性收縮抽動(dòng)為宜，1 次/d，連續(xù)7 d；參照文獻(xiàn)準(zhǔn)確定位[13-14]，大椎穴：背部正中第7 頸椎和第1 胸椎間，直刺5 mm。次髎穴：第2、3 骶骨的棘突間隙正中偏上旁開(kāi)5～10 mm（左右隔日交替進(jìn)行），直刺5～12 mm。電針對(duì)照組的針刺點(diǎn)分別選取以大椎穴、次髎穴為中心旁開(kāi)10 mm 處（遠(yuǎn)脊柱側(cè)）[15]，針刺，電針儀參數(shù)同上，留針20 min，1 次/d，連續(xù)1 周。

1.6 尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

末次電針干預(yù)完成后1 h，各組大鼠以1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后手法按壓大鼠下腹部進(jìn)行輔助排尿，排空膀胱后將大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，導(dǎo)管經(jīng)三通管連接測(cè)壓通道及微量灌注泵，排空管腔氣體，導(dǎo)管潤(rùn)滑后經(jīng)尿道插入大鼠膀胱并固定，此時(shí)壓力值為膀胱基礎(chǔ)壓力，隨后以7.5 ml/h 的速度進(jìn)行溫生理鹽水灌注，觀察隨膀胱灌注量的增加大鼠膀胱壓力的變化。尿道口有液體流出時(shí)，即為膀胱漏尿點(diǎn)壓力和膀胱最大容量。漏尿后繼續(xù)灌注至逼尿肌壓力穩(wěn)定，取壓力峰值為膀胱最大壓力，計(jì)算得出膀胱順應(yīng)性。

1.7 CyclinD1、Ngn1 mRNA和蛋白檢測(cè)

尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)完成后，頸椎脫位處死大鼠，于脊髓橫斷處，向下截取脊髓殘端5～10 mm，分置2 份于1.5 ml 凍存管中，置入-80℃冰箱冷凍保存，一份用于RT-PCR 檢測(cè)CyclinD1 和Ngn1 mRNA 表達(dá)，另一份用于Western blotting 法檢測(cè)CyclinD1 和Ngn1蛋白表達(dá)。向上截取脊髓殘端5～10 mm，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，常溫固定24 h 以上，用于免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CyclinD1、Ngn1的表達(dá)。

1.7.1 RT-PCR 檢測(cè)各組大鼠脊髓組織中CyclinD1、Ngn1 mRNA 表達(dá)Trizol 裂解法提取脊髓組織中總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再以CyclinD1、Ngn1 擴(kuò)增引物（見(jiàn)表1）為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行水平電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)中采集電泳圖像，并測(cè)定目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的積分光密度值，以大鼠脊髓組織中CyclinD1 和Ngn1 條帶與βactin 條帶灰度值的比值表示mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.7.2 Western blotting 檢測(cè)脊髓組織中CyclinD1、Ngn1蛋白表達(dá)常規(guī)提取脊髓組織中總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液，沸水浴中變性5 min，按照50 μg/孔的蛋白總量進(jìn)行垂直電泳，電泳完成后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，取出PVDF 膜，TBST 緩沖液沖洗，5%BSA 封閉液中封閉1 h，浸泡于一抗（1∶500）中，4℃孵育過(guò)夜，次日洗膜，浸泡于二抗（1∶2 000）中，室溫?fù)u床上震蕩孵育2 h，洗膜，將PVDF膜放入凝膠成像分析系統(tǒng)中，滴加ECL 發(fā)光液，采集條帶照片，以β-actin 為內(nèi)參，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)脊髓組織中CyclinD1、Ngn1 蛋白表達(dá)常規(guī)制備石蠟切片，切片厚度為5 μm，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，浸入檸檬酸鹽緩沖液中，沸水浴中加熱20 min 進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加3%H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。滴加5%BSA 封閉液，封閉15 min，分別滴加CyclinD1 抗體和Ngn1抗體工作液，稀釋度為1∶300，4℃孵育過(guò)夜。次日洗片后滴加二抗工作液，37℃恒溫水浴鍋中孵育1 h，洗片后滴加DAB 顯色液，顯色3～10 min，需實(shí)時(shí)觀察切片染色情況，自來(lái)水下沖洗，終止染色。蘇木精復(fù)染后1%鹽酸乙醇分化，中性樹(shù)膠封片，數(shù)碼顯微鏡下觀察切片。選取染色良好區(qū)域，每張切片拍攝5 張照片，測(cè)定每個(gè)視野的平均光密度值，5 張照片的平均值作為該目的蛋白的相對(duì)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

術(shù)前所有實(shí)驗(yàn)大鼠食水、活動(dòng)正常，自主排尿。術(shù)后假手術(shù)組大鼠常規(guī)護(hù)理，較術(shù)前差異不大。模型組大鼠1～2 h 麻醉蘇醒，雙后肢無(wú)任何運(yùn)動(dòng)，食水量下降，出現(xiàn)自嚙、血尿、腹脹、腸梗阻等情況，均予以對(duì)癥處理。至模型復(fù)制成功前共剔除12 只大鼠（術(shù)后BBB 評(píng)分> 0 分4 只，自嚙1 只，血尿1 只，腹脹1 只，腸梗阻2 只，第15 天仍存在尿潴留3 只）。

2.2 模型評(píng)價(jià)

2.2.1 BBB 評(píng)分假手術(shù)組大鼠的BBB 評(píng)分為（21.000±0.000）分，無(wú)行動(dòng)功能障礙，模型復(fù)制后模型組大鼠的BBB 評(píng)分為（0.080±0.279）分，行動(dòng)功能下降。假手術(shù)組和模型組大鼠BBB 評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=257.755，P=0.000）。

2.2.2 尿流動(dòng)力學(xué)的變化術(shù)后第15 天，假手術(shù)組和模型組大鼠的膀胱基礎(chǔ)壓力、膀胱最大壓力、膀胱漏尿點(diǎn)壓力、膀胱最大容量及膀胱順應(yīng)性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），模型組大鼠膀胱基礎(chǔ)壓力、膀胱最大壓力及膀胱漏尿點(diǎn)壓力升高，膀胱最大容量和膀胱順應(yīng)性降低。見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較 （±s）

表2 兩組大鼠尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較 （±s）

組別n 膀胱基礎(chǔ)壓力/cmH2O 膀胱最大壓力/cmH2O 膀胱漏尿點(diǎn)壓力/cmH2O 膀胱最大容量/ml 膀胱順應(yīng)性/（ml/cmH2O）假手術(shù)組模型組t 值P 值12 48 19.800±1.914 36.902±2.144-24.535 0.000 38.050±2.681 60.345±2.865-23.701 0.000 37.325±2.897 53.818±2.636-18.320 0.000 5.100±1.421 0.702±0.165 18.597 0.000 0.292±0.119 0.030±0.007 13.435 0.000

2.3 電針干預(yù)后尿流動(dòng)力學(xué)的變化

電針干預(yù)后4 組大鼠膀胱基礎(chǔ)壓力、膀胱最大壓力、膀胱漏尿點(diǎn)壓力、膀胱最大容量、膀胱順應(yīng)性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與假手術(shù)組比較，其余3 組大鼠膀胱基礎(chǔ)壓力和膀胱最大壓力升高（P<0.05），膀胱最大容量和膀胱順應(yīng)性降低（P<0.05），模型對(duì)照組和電針對(duì)照組膀胱漏尿點(diǎn)壓力升高（P<0.05），電針組膀胱漏尿點(diǎn)壓力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型對(duì)照組比較，電針組大鼠膀胱基礎(chǔ)壓力、膀胱最大壓力和膀胱漏尿點(diǎn)壓力降低（P<0.05），膀胱最大容量和膀胱順應(yīng)性升高（P<0.05）；模型對(duì)照組與電針對(duì)照組比較，尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與電針組比較，電針對(duì)照組大鼠膀胱基礎(chǔ)壓力、膀胱最大壓力和膀胱漏尿點(diǎn)壓力升高（P<0.05），膀胱最大容量和膀胱順應(yīng)性降低（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠電針干預(yù)后尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較 （n=12,-x± s）

2.4 4組大鼠脊髓組織中CyclinD1和Ngn1 mRNA表達(dá)比較

4 組大鼠脊髓組織中CyclinD1 和Ngn1 mRNA 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與假手術(shù)組比較，其余3組CyclinD1 mRNA表達(dá)升高（P<0.05），Ngn1 mRNA表達(dá)降低（P<0.05）；與模型對(duì)照組比較，電針組CyclinD1 和Ngn1 mRNA表達(dá)升高（P<0.05）；模型對(duì)照組與電針對(duì)照組CyclinD1 和Ngn1 mRNA 表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與電針組比較，電針對(duì)照組CyclinD1和Ngn1 mRNA表達(dá)降低（P<0.05）。見(jiàn)表4和圖1。

表4 4組大鼠脊髓組織中Cyclin D1和Ngn1 mRNA表達(dá)比較 （n=12,-x± s）

圖1 4組大鼠脊髓組織中CyclinD1和Ngn1 mRNA表達(dá)

2.5 4組大鼠脊髓組織中CyclinD1和Ngn1蛋白表達(dá)比較

4 組大鼠脊髓組織中CyclinD1 和Ngn1 蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與假手術(shù)組比較，其余3組CyclinD1蛋白表達(dá)升高（P<0.05），模型對(duì)照組和電針對(duì)照組Ngn1蛋白表達(dá)降低（P<0.05），電針組Ngn1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型對(duì)照組比較，電針組CyclinD1和Ngn1蛋白表達(dá)升高（P<0.05），電針對(duì)照組CyclinD1和Ngn1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與電針組比較，電針對(duì)照組CyclinD1 和Ngn1蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。見(jiàn)表5和圖2。

表5 4組大鼠脊髓組織中CyclinD1和Ngn1蛋白表達(dá)比較（n=12,-x± s）

圖2 4組大鼠脊髓組織中CyclinD1和Ngn1蛋白表達(dá)

2.6 4 組大鼠脊髓組織切片的CyclinD1 和Ngn1蛋白表達(dá)

4 組大鼠脊髓組織切片CyclinD1 和Ngn1 蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與假手術(shù)組比較，其余3組CyclinD1蛋白表達(dá)升高（P<0.05），模型對(duì)照組和電針對(duì)照組Ngn1 蛋白表達(dá)降低（P<0.05），電針組Ngn1 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型對(duì)照組比較，電針組CyclinD1 和Ngn1蛋白表達(dá)升高（P<0.05），電針對(duì)照組CyclinD1 和Ngn1 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與電針組比較，電針對(duì)照組CyclinD1 和Ngn1蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。見(jiàn)表6和圖3、4。

表6 4組大鼠脊髓組織切片的CyclinD1和Ngn1蛋白表達(dá)比較 （n=12,-x± s）

圖3 4組大鼠脊髓組織切片中CyclinD1蛋白表達(dá) （IHC×400）

圖4 4組大鼠脊髓組織切片中Ngn1蛋白表達(dá) （IHC×400）

3 討論

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)歸納完全性SSCI 后NB 的病機(jī)為：督脈不通、淤血凝滯[16]。督脈上始于腦，下止于骶，經(jīng)脊里與五臟六腑氣血經(jīng)脈相表里。與西醫(yī)脊髓生理解剖定位相一致。電針大椎穴和次髎穴為干預(yù)手段，在取穴上嚴(yán)格做到單一變量控制，在體內(nèi)形成一條正負(fù)電流，達(dá)到通督補(bǔ)腎、恢復(fù)膀胱氣化功能，改善臨床癥狀。有研究證實(shí)[17]，電針在促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮著重要作用。

本研究復(fù)制完全性SSCI后NB大鼠模型，以BBB評(píng)分作為模型大鼠雙下肢行為學(xué)評(píng)價(jià)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，判斷模型大鼠脊髓是否為完全損傷。與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠BBB 評(píng)分下降，證明模型組大鼠雙后肢完全喪失運(yùn)動(dòng)功能，脊髓橫斷。術(shù)后大鼠正常飼養(yǎng)至第15 天，采用尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，形成“高壓低順應(yīng)性”膀胱。在電針干預(yù)1周后再次采用尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，與模型對(duì)照組比較，電針組大鼠膀胱基礎(chǔ)壓力、膀胱最大壓力和膀胱漏尿點(diǎn)壓力下降，膀胱最大容量和膀胱順應(yīng)性升高；與電針組比較，電針對(duì)照組大鼠膀胱基礎(chǔ)壓力、膀胱最大壓力和膀胱漏尿點(diǎn)壓力升高，膀胱最大容量和膀胱順應(yīng)性下降。說(shuō)明電針大椎穴和次髎穴可以有效調(diào)節(jié)完全性SSCI后NB大鼠的排尿功能。

SCI 后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)短暫性增殖反應(yīng)增強(qiáng)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化為功能性神經(jīng)元[18]。電針大椎穴和次髎穴能夠進(jìn)一步激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，上調(diào)Wnt-1、β-catenin mRNA及蛋白的表達(dá)[11]。Cyclin D1和Ngn1 是Wnt/β-catenin 信號(hào)通路下游靶基因[19]。CyclinD1 是細(xì)胞周期增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白。羅時(shí)鵬等[20]研究表明，CyclinD1 與β-catenin 的表達(dá)呈正相關(guān)。本研究的前期研究發(fā)現(xiàn)[11]，完全性SSCI 能夠激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組β-catenin 的表達(dá)升高，與模型對(duì)照組比較，電針組β-catenin 的表達(dá)升高。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，其他3組大鼠CyclinD1 mRNA 及蛋白表達(dá)升高；與模型對(duì)照組比較，電針組大鼠CyclinD1 mRNA及蛋白表達(dá)升高；與電針組比較，電針對(duì)照組大鼠Cyclin D1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平降低。Ngn1 在神經(jīng)分化中起重要作用[21]。有研究表明[22]，完全性SCI后假手術(shù)組與模型組均未檢出Ngn1 mRNA 的表達(dá)。在SCI 后Ngn1 的表達(dá)與假手術(shù)組比較呈下降趨勢(shì)[23]。張巧梅[24]的研究發(fā)現(xiàn)，Ngn1 能夠短暫表達(dá)于神經(jīng)增殖細(xì)胞，當(dāng)神經(jīng)增殖細(xì)胞分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型后其表達(dá)消失。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠Ngn1 mRNA 及蛋白表達(dá)降低；與模型對(duì)照組比較，電針組大鼠Ngn1 mRNA 及蛋白表達(dá)升高；與電針組比較，電針對(duì)照組大鼠Ngn1 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低。說(shuō)明電針干預(yù)能夠增加Ngn1在模型大鼠脊髓組織中的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)一步分化，恢復(fù)受損組織神經(jīng)功能。大鼠脊髓組織中CyclinD1 和Ngn1 mRNA 及蛋白在電針組和電針對(duì)照組的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明取穴準(zhǔn)確，具有相對(duì)特異性。

綜上所述，電針大椎穴、次髎穴對(duì)完全性SSCI后NB 大鼠尿流動(dòng)力學(xué)具有明顯改善作用，其作用機(jī)制之一是通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路中CyclinD1和Ngn1 mRNA 及蛋白表達(dá)，促進(jìn)脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和活化而實(shí)現(xiàn)。在今后的研究中，應(yīng)增加時(shí)間點(diǎn)的選擇，以便研究觀察指標(biāo)的變化趨勢(shì)，尋求最佳治療周期。在確定最佳治療周期的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討治療后有效性的持續(xù)時(shí)間，細(xì)化研究?jī)?nèi)容，精確指導(dǎo)臨床應(yīng)用；進(jìn)一步完善Wnt信號(hào)通路中其他相關(guān)蛋白的檢測(cè)，增加Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白抑制劑應(yīng)用后的變化研究，繼續(xù)探討Wnt信號(hào)通路中相關(guān)因子變化與神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin表達(dá)的相關(guān)性。