劉蓉蓉，聶麗華 綜述，楊 欣 審校

重慶北部寬仁醫(yī)院耳鼻喉科，重慶 401120

變應(yīng)性鼻炎(AR)為臨床常見疾病，患者以鼻癢、陣發(fā)性噴嚏、多清涕、鼻阻為主要臨床表現(xiàn)，可合并變應(yīng)性結(jié)膜炎、變應(yīng)性哮喘等多種疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至危及生命。目前臨床治療手段非常有限，以藥物控制為主，但難以解決部分患者療效不佳及停藥后復(fù)發(fā)問題。免疫治療是在探討AR發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)上，力圖阻斷變態(tài)反應(yīng)病理機(jī)制中的一個(gè)或多個(gè)有效環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮治療作用。免疫治療是目前最具前景和最值得期待的研究方向。本文重點(diǎn)綜述各細(xì)胞因子抗體在AR治療中的作用和相關(guān)分子機(jī)制，希望能為AR免疫治療的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體

TNF-α是一種多功能炎癥細(xì)胞因子，主要由單核-巨噬細(xì)胞通過免疫球蛋白(Ig)E依賴的方式產(chǎn)生并釋放，可促使Th細(xì)胞向Th2方向分化，導(dǎo)致Th1/Th2分泌的細(xì)胞因子失衡，誘導(dǎo)由免疫球蛋白(Ig)E介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，是AR治療研究的靶點(diǎn)之一[1]。唐橋斐等[2]采用腹腔注射及鼻腔滴注卵清蛋白(OVA)的方法成功建立AR小鼠模型。實(shí)驗(yàn)組小鼠鼻腔滴入TNF-α單克隆抗體，并對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。建模成功后處死小鼠，取其鼻腔分泌物及鼻黏膜組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，TUNEL原位末端標(biāo)記法觀察細(xì)胞凋亡情況，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)鼻黏膜液中TNF-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IgE的表達(dá)水平，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)核因子(NF)-κB p65、NF-κB抑制蛋白及凋亡相關(guān)蛋白水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的鼻腔黏膜炎性反應(yīng)明顯減輕，組織切片中無明顯腺體增生和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，凋亡細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯減少。此外，TNF-α、IL-1β、IgE水平均降低，NF-κB p65、cleaved caspase-3、Bax相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.01)，NF-κB抑制蛋白與B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.01)。TNF-α抗體能有效減少鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量和趨化因子的表達(dá)，并抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減低特異性變態(tài)反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)AR起到治療作用，這一結(jié)論已得到相關(guān)研究證實(shí)[3]。

自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)程序性死亡的一種特殊方式，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[4]。AR大鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞中存在線粒體自噬現(xiàn)象[5]，應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基嘌呤可顯著改善OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺組織的病理學(xué)變化，降低肺泡灌洗液中嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量[6]，說明自噬參與了變態(tài)反應(yīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展，但具體機(jī)制尚不明確。張爽等[7]的研究結(jié)果顯示，AR小鼠鼻黏膜組織中LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin-1、ATG5及ATG7的表達(dá)水平較對(duì)照組升高，p62的表達(dá)水平降低，進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞自噬參與了AR的發(fā)病機(jī)制。而采用TNF-α單克隆抗體干預(yù)后，上述細(xì)胞因子的表達(dá)水平明顯降低，p62的表達(dá)水平明顯升高。自噬抑制劑3-甲基嘌呤和激活劑西羅莫司的相反作用，更進(jìn)一步證實(shí)了TNF-α單克隆抗體對(duì)AR小鼠的治療作用可能同降低細(xì)胞自噬水平有關(guān)。

2 IL-17/IL-6抗體

董慶喆等[8]的研究方法與唐橋斐等[2]相似，通過小鼠腹腔注射及鼻腔滴注OVA建立AR模型成功后，在每次鼻腔激發(fā)之前的不同時(shí)間給予生理鹽水和不同劑量的IL-17 mAb滴鼻和(或)腹腔注射，進(jìn)而對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，用迪夫快速染色液法觀察鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清及鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10水平，鼻黏膜組織行甲苯胺藍(lán)染色觀察肥大細(xì)胞數(shù)量及脫顆粒情況。研究結(jié)果表明，F(xiàn)組小鼠(于每次OVA鼻腔激發(fā)前4 h給予5 μg IL-17 mAb腹腔注射)行為學(xué)評(píng)分(撓鼻及噴嚏次數(shù))，以及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IL-17A是Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的合成和分泌，是一種致炎細(xì)胞因子[9]，在變態(tài)反應(yīng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。高劑量的(5 μg)IL-17 mAb腹腔注射處于激發(fā)階段的AR小鼠，促使AR小鼠血清中IL-6水平降低，而血清中及鼻腔灌洗液中IL-10水平升高，這些細(xì)胞因子的水平變化可能是通過抑制Th17，從而促進(jìn)Treg的分化，進(jìn)而對(duì)變態(tài)反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。該研究證實(shí)了IL-17單克隆抗體對(duì)AR具有治療作用，但并未給出推薦的劑量和給藥途徑，尚有待進(jìn)一步研究。

IL-6主要由淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，既是促炎因子又是抑炎因子。它是感染性疾病、關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疾病處于急性期時(shí)的一種重要炎癥介質(zhì)。IL-6水平與疾病治療效果密切相關(guān)[10]。劉陽(yáng)等[11]的研究證實(shí)IL-6抗體對(duì)AR小鼠有明確的治療作用：在激發(fā)階段鼻腔給予IL-6抗體后，小鼠鼻腔灌洗液中Th2細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-4水平明顯降低，而Th1細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子干擾素-γ沒有明顯變化，提示IL-6抗體可能通過直接或間接抑制Th2細(xì)胞因子分泌，從而抑制變態(tài)反應(yīng)，具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

3 IgE單克隆抗體

奧馬珠單克隆抗體是目前最具代表性的IgE單克隆抗體，是通過雜交瘤技術(shù)獲取的重組人源化IgE單克隆抗體。為了避免發(fā)生藥敏反應(yīng)，人為去除了抗原決定區(qū)，僅保留與IgE結(jié)合的互補(bǔ)決定區(qū)，奧馬珠單克隆抗體具有高IgE特異性和結(jié)合力，但僅與游離IgE結(jié)合，以避免受體交聯(lián)和相關(guān)炎癥細(xì)胞的激活，這是其安全性的重要保證。除了細(xì)胞免疫之外，因?yàn)閵W馬珠單克隆抗體能與B淋巴母細(xì)胞和記憶B淋巴細(xì)胞膜表面的IgE結(jié)合，因此對(duì)體液免疫也有一定的抑制作用。目前，奧馬珠單克隆抗體主要用于12歲以上中、重度變應(yīng)性哮喘的第五級(jí)治療[12-13]，但其對(duì)AR的治療作用也正日益受到關(guān)注。

奧馬珠單克隆抗體的治療效果具有劑量依賴性，給藥劑量取決于患者治療前的體質(zhì)量和血清IgE水平，當(dāng)奧馬珠單克隆抗體的劑量達(dá)到基礎(chǔ)IgE水平的15倍以上時(shí)，即可迅速降低血清中游離IgE的水平，進(jìn)而對(duì)變應(yīng)性哮喘和AR起到顯著的治療效果，尤其對(duì)中、重度AR治療效果更佳。但奧馬珠單克隆抗體起效緩慢，至少需要28周的時(shí)間，對(duì)于急性哮喘和鼻炎發(fā)作的患者而言，給藥周期過長(zhǎng)。而且奧馬珠單克隆抗體的療效與血清游離IgE水平密切相關(guān)，所以在臨床癥狀緩解后不能驟然停藥，否則將引起血清游離IgE水平驟然升高，從而導(dǎo)致哮喘和鼻炎復(fù)發(fā)并加重，甚至引發(fā)生命危險(xiǎn)。奧馬珠單克隆抗體總體耐受性良好，常見不良反應(yīng)有頭痛、上呼吸道感染、注射部位紅腫等，?？勺孕邢?，目前尚未見藥物過敏等嚴(yán)重不良反應(yīng)的報(bào)道，臨床應(yīng)用前景廣闊[14]。

奧馬珠單克隆抗體的安全性在其他研究中也得到證實(shí)，LIAO等[15]報(bào)道2例接受奧馬珠單克隆抗體治療的妊娠期慢性自發(fā)性蕁麻疹患者，并回顧分析11例妊娠期接受奧馬珠單克隆抗體治療患者的公開資料。結(jié)論是所有患者的慢性自發(fā)性蕁麻疹得到有效控制，孕期無明顯不良反應(yīng)，并最終產(chǎn)下健康嬰兒。

利格列珠單克隆抗體是人源化IgE抗體，與IgE結(jié)合的親和力高于奧馬珠單克隆抗體。TRISCHLER等[16]的多中心、隨機(jī)、雙盲研究證實(shí)，利格列珠單克隆抗體對(duì)輕度過敏性哮喘患者吸入和皮膚過敏源激發(fā)反應(yīng)的療效大于奧馬珠單克隆抗體，但對(duì)于大劑量吸入皮質(zhì)激素聯(lián)合長(zhǎng)效β2-激動(dòng)劑未得到充分控制的重癥哮喘患者，利格列珠單克隆抗體并未顯示出優(yōu)于安慰劑或奧馬珠單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)。

4 趨化因子受體抗體

趨化因子是由成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、激活的血小板等分泌的一類小分子分泌型蛋白質(zhì)，由70～100個(gè)氨基酸組成。其主要作用是通過與趨化因子受體結(jié)合，趨化各類炎癥細(xì)胞在局部聚集，從而引發(fā)炎性反應(yīng)，如AR患者的鼻黏膜組織切片中可以見到大量的嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，且都處于活化狀態(tài)。與AR的發(fā)病關(guān)系較密切的趨化因子是CCL和CXCL兩類。

Rantes/CCL5是CCL家族中的一種趨化嗜酸粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的趨化因子。Rantes在AR鼻黏膜組織勻漿中的水平明顯高于正常鼻黏膜組織，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)也證實(shí)Rantes的mRNA表達(dá)明顯升高。應(yīng)用Rantes受體拮抗劑AOP-Rantes可以有效阻止嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在鼻黏膜的局部聚集，從而減輕鼻炎癥狀。Eotaxin也是屬于CCL家族，由73個(gè)氨基酸組成，是一種嗜酸粒細(xì)胞特異性趨化因子。HANAZAWA等[17]對(duì)9例AR患者采用Eotaxin噴鼻，結(jié)果誘發(fā)典型的AR癥狀，鼻腔灌洗液中發(fā)現(xiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞，而在鼻腔灌洗液和鼻黏膜中淋巴細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量并無改變,因此推測(cè)Eotaxin是嗜酸粒細(xì)胞特異性趨化因子，與AR發(fā)病有著密切的關(guān)系。Eotaxin可以動(dòng)員骨髓中的嗜酸性粒細(xì)胞入血，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，增加血管通透性，使其得以在局部組織聚集，并活化局部組織的嗜酸性粒細(xì)胞，釋放炎癥因子而引發(fā)變態(tài)反應(yīng)。

單核細(xì)胞趨化蛋白(MCPs1-5)也是一種CCL類趨化因子，其中與AR有關(guān)的亞型主要是MCP-1、MCP-3、MCP-4。組胺能誘導(dǎo)AR患者鼻黏膜中CCL類趨化因子(包括MCP-1、MCP-3、Eotaxin、Rantes)的表達(dá)，而這些趨化因子又促進(jìn)炎癥細(xì)胞在局部聚集，進(jìn)一步釋放組胺等炎癥遞質(zhì)，如此形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致AR加重和反復(fù)發(fā)作。

所有的趨化因子都是通過與其相應(yīng)的趨化因子受體結(jié)合而發(fā)揮作用。具有抗原提呈作用的樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)CCR7，通過與CCL21結(jié)合，促使樹突狀細(xì)胞從淋巴結(jié)游走并聚集到炎癥局部，Th0細(xì)胞接觸到樹突狀細(xì)胞提呈的變應(yīng)原后，分化為Th2細(xì)胞，導(dǎo)致Th2與Th1細(xì)胞失衡。Th2細(xì)胞表面主要表達(dá)CCR4和CCR8，而Th1細(xì)胞表面主要表達(dá)CXCR3和CCR5。Th2細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-4和IL-13，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化產(chǎn)生抗原特異性IgE，IgE及其特異性高親和力受體FcεRI在肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞表面結(jié)合，完成過敏反應(yīng)的致敏階段，當(dāng)機(jī)體再次接觸過敏源時(shí)，過敏源直接與致敏細(xì)胞膜上的受體FcεRI結(jié)合，產(chǎn)生IgE交聯(lián)，激活下游信號(hào)通路，誘發(fā)瀑布式級(jí)聯(lián)變態(tài)反應(yīng)，使機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的過敏癥狀[18]。

嗜酸粒細(xì)胞是呼吸道過敏性疾病中的主要效應(yīng)細(xì)胞，其表面主要表達(dá)CCR3和CCR1，以CCR3為主。CCR3能與多種CCL類趨化因子結(jié)合，包括Rantes、Eotaxin、MCP-1、MCP-3等，是介導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞到達(dá)炎癥局部的主要趨化因子受體，在AR的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。有研究證實(shí)，抗原激發(fā)后嗜酸性粒細(xì)胞、CD34+、CD34+/CCR3+在哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液、外周血骨髓懸液中有不同程度的升高[18]。模型組小鼠的肺泡灌洗液中Eotaxin水平在抗原激發(fā)后6 h與對(duì)照組相比有明顯升高[19]?？?CCR3單克隆抗體可能成為AR免疫治療中重要的研究方向。

CCR3主要位于細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中[20]。CCR3可以與CCL11、CCL24、CCL26等多種趨化因子結(jié)合，其中對(duì)CCL11親和力最大[21]。CCR3由胞外N-末端、7個(gè)跨膜α螺旋(TM核心)、胞內(nèi)C-末端、3個(gè)胞內(nèi)環(huán)和胞外環(huán)組成。趨化因子與胞外N-末端及胞外環(huán)結(jié)合后，誘導(dǎo)CCR3發(fā)生變構(gòu)和磷酸化，激活PI3K信號(hào)通路，從而激發(fā)ERK1/2，PI3Kγ等多種下游信號(hào)通路發(fā)生作用[22]。CCR3主要通過與自分泌的Eotaxin結(jié)合，誘發(fā)嗜酸性粒細(xì)胞原位造血，即誘導(dǎo)CD34+、CD38+等多種骨髓干細(xì)胞向嗜酸性粒細(xì)胞分化并向炎癥部位聚集，進(jìn)而通過胞吐作用、零碎脫顆粒、細(xì)胞溶解等多種方式進(jìn)行脫顆粒，釋放嗜酸粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、嗜酸粒細(xì)胞過氧化物酶、嗜酸粒細(xì)胞源神經(jīng)毒素、主要堿性蛋白等多種炎癥介質(zhì)[23-25]，破壞細(xì)胞膜磷脂雙分子層的完整性，從而損傷氣道上皮，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)，還可以通過合成白三烯誘發(fā)劇烈的氣道收縮，最終導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)性病理改變和臨床癥狀[26]。

肥大細(xì)胞也是變態(tài)反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，由骨髓中表達(dá)CD34+、CD117+和CD13+的多能祖細(xì)胞分化而成。根據(jù)肥大細(xì)胞分泌顆粒的特異性及蛋白酶差異，將人類肥大細(xì)胞分為MCT和MCTC兩種亞型，后者主要存在于皮膚及黏膜下層。在接觸過敏源后，肥大細(xì)胞升高Eotaxin-1的表達(dá)，其N-末端絲氨酸殘基可與CCR3特異性定向結(jié)合，CCR3通過激活G蛋白釋放FcεRIa亞基，然后將其耦合到磷脂酰肌醇3-激酶γ并擴(kuò)增變應(yīng)原刺激的Ca2+內(nèi)流，刺激肥大細(xì)胞脫顆粒。FcεRI的四聚體與IgE結(jié)合的高親和力及緩慢解離的特點(diǎn)，決定其在速發(fā)相過敏反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，也是肥大細(xì)胞持續(xù)致敏和對(duì)過敏源易感的基礎(chǔ)[27]。CCR3抗體能有效阻斷上述信號(hào)傳導(dǎo)通路，在各種變態(tài)反應(yīng)性疾病中起到治療作用。CCR3基因敲除或應(yīng)用CCR3抑制劑AXP1275均可明顯抑制AR小鼠鼻黏膜內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒過程、IgE表達(dá)等[28]。

5 小 結(jié)

變態(tài)反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞因子和信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)其分子機(jī)制的探討是治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。目前針對(duì)不同環(huán)節(jié)的免疫治療研究已經(jīng)取得諸多進(jìn)展，但部分分子機(jī)制尚未完全闡明，距離臨床應(yīng)用尚有漫長(zhǎng)的道路，需要更加深入的研究和思考。