皇甫海燕，史志丹，郝麗芬，燕孟嬌，宋培玲，楊永青，賈曉清，皇甫九茹，郭 晨，李子欽

(內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

油菜黑脛病(Blackleg)，是由黑脛病菌(Leptosphaeriabiglobosa)病原真菌引起的一種真菌病害[1]，可危害油菜的葉片、莖稈、角果等組織[2]，導(dǎo)致我國(guó)油菜產(chǎn)量損失、品質(zhì)下降[3-4]。目前，我國(guó)已經(jīng)開展了油菜Leptosphaeriabiglobosa的生物學(xué)特性[5-6]、侵染條件和途徑[7]、遺傳多樣性[8]、致病力分化[9]等方面的研究，但還未見關(guān)于黑脛病菌致病機(jī)制研究的報(bào)道。

T-DNA插入目的基因的突變體技術(shù)是將T-DNA片段隨機(jī)插入病原菌基因組引起某段基因突變，從而造成該基因功能缺失，進(jìn)而通過表型變化來解析目的基因功能的方法[10]。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)是應(yīng)用最為廣泛的T-DNA突變體技術(shù)，該方法具有插入拷貝數(shù)少、轉(zhuǎn)化效率高[11]、操作簡(jiǎn)便并易得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子等特點(diǎn)[12]。利用該方法構(gòu)建突變體庫(kù)，從中篩選獲得致病力減弱的突變體，通過對(duì)病原菌的表型鑒定和分析插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，確定發(fā)生突變的基因，分離和研究病原菌致病相關(guān)基因及其功能[13]。目前T-DNA 插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的擴(kuò)增多采用半隨機(jī)引物PCR法，主要包括：熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR法(TAIL-PCR)、高效熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Hi TAIL-PCR)、限制位點(diǎn)PCR(Restriction-site PCR，RSPCR)、單寡核苷酸巢式PCR(Single oligonucleotidenested PCR，SON-PCR)，其中前2種方法應(yīng)用較多[14]。因此，本研究從T-DNA插入Leptosphaeriabiglobosa突變體庫(kù)中，篩選致病力減弱的突變體，并對(duì)其表型特征進(jìn)行觀察，隨后利用Hi TAIL-PCR擴(kuò)增其側(cè)翼序列，通過GenBank上Blast比對(duì)序列，初步確定了致病力減弱突變體的T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，為進(jìn)一步篩選Leptosphaeriabiglobosa致病基因提供研究基礎(chǔ)，并為其致病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料、菌株及質(zhì)粒 供試甘藍(lán)型油菜品種為青雜5號(hào)；野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存。Leptosphaeriabiglobosanm-1T-DNA突變體庫(kù)由雙元載體pCH-sGFP-GUS作為轉(zhuǎn)化供體所得，其中pCH-sGFP質(zhì)粒由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)趙君教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶PstⅠ，DNA瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒，CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒，購(gòu)自TaKaRa寶生物工程大連有限公司；地高辛雜交檢測(cè)試劑盒Ⅱ(化學(xué)發(fā)光法)，PCR DIG Probe Synthesis Kit，購(gòu)自Roche公司；HyBond N+正電荷尼龍膜，購(gòu)自Amersham公司；引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 致病力減弱突變體的篩選 基于前期試驗(yàn)，構(gòu)建獲得T-DNA突變體庫(kù)[15-16]，從中隨機(jī)挑取16株單孢分離后的突變體菌株，以野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1為對(duì)照，接種于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)12～15 d，刮取分生孢子，制備孢子懸浮液，將濃度調(diào)至0.2×106個(gè)/mL后備用。采用穿刺接種法[17]對(duì)突變體的致病性進(jìn)行鑒定，具體是將10 μL的孢子懸浮液接種于油菜子葉上，每個(gè)突變體最少接種10片子葉，12 d后調(diào)查油菜的發(fā)病情況及病情指數(shù)，篩選出致病力減弱突變體，重復(fù)3次。

1.2.2 致病力減弱突變體菌落形態(tài)及生長(zhǎng)速率測(cè)定 調(diào)查不同突變體菌株的致病力，挑選出致病力下降程度大的突變體菌株，以野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1作為對(duì)照，將菌餅(Φ=3.5mm)轉(zhuǎn)接在PDA上，25 ℃培養(yǎng)7 d后，觀察其菌落形態(tài)，并拍照記錄，同時(shí)測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率(cm/d)，重復(fù)3次。

1.2.3 致病力減弱突變體菌株產(chǎn)孢量的測(cè)定 將以上挑選的致病力減弱突變體，以Leptosphaeriabiglobosanm-1作為對(duì)照，PDA上25 ℃培養(yǎng)14 d后，獲得分生孢子懸浮液后，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算其產(chǎn)孢量，重復(fù)3次。

1.2.4 致病力減弱突變菌株的Southern Blot檢測(cè) CTAB法提取致病力減弱突變體和Leptosphaeriabiglobosanm-1基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切，電泳后轉(zhuǎn)到尼龍膜上，采用紫外交聯(lián)儀將核酸固定。再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的DIG標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，雜交完成后進(jìn)行洗膜及信號(hào)檢測(cè)。

1.2.5 T-DNA插入側(cè)翼序列的克隆、測(cè)序和分析 利用高效熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Hi TAIL-PCR)擴(kuò)增T-DNA插入側(cè)翼序列，簡(jiǎn)并引物為L(zhǎng)AD1～LAD5；特異性嵌套引物為RB1～RB3(表1)，與通用簡(jiǎn)并引物L(fēng)AD和接頭序列AC組合，以野生型菌株和致病力減弱突變體菌株基因組DNA 為模板進(jìn)行3 輪Hi TAIL-PCR 反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[18]，將第3輪PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收、TA 克隆，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast查詢比對(duì)。

表1 Hi TAIL-PCR擴(kuò)增側(cè)翼序列引物Tab.1 Primers for amplifying flanking sequence by Hi TAIL-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 致病力減弱突變菌株的獲得

測(cè)定16株突變體菌株的致病力(圖1)，野生型菌株Leptosphaeriabiglobosanm-1作為對(duì)照，其中3株突變體菌株的相對(duì)病情指數(shù)顯著高于對(duì)照(P>0.05)，分別是T17、T18、T21。12株突變體菌株的相對(duì)病情指數(shù)比對(duì)照小，分別為T1、T3、T4、T5、T7、T8、T9、T10、T11、T12、T13、T14。其中野生型菌株nm-1病情指數(shù)為48.6，突變體T1的病情指數(shù)為35.5，T3為32.5，T4為31.3，T5為41.3，T7為35.3，T8為42.3，T9為31.0，T10為42.5，T11為25.4，T12為46.3，T13為44.6，T14為37.8，分別降低了27.0%，33.2%，35.8%，15.0%，27.4%，36.2%，13.0%，36.2%，12.6%，47.7%，8.2%，22.2%。與野生型菌株nm-1相比，T1、T3、T4、T5、T7、T9、T11、T14這8株突變體菌株的致病力顯著降低(P<0.05)，為致病力減弱菌株。

2.2 致病力減弱突變體的菌落形態(tài)特征

通過上述試驗(yàn)，最后篩選出6個(gè)致病力減弱突變體(T1、T3、T4、T7、T9、T11、T14)，培養(yǎng)7 d后，對(duì)這些突變體的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體T1、T3、T4、T7與野生型菌株nm-1菌落形態(tài)相比基本沒有差異，而突變體T9、T11菌絲形態(tài)致密，緊致，沒有產(chǎn)生孢子，與野生型菌株nm-1相比，具有較大差異(圖2)。

2.3 致病力減弱突變體的生長(zhǎng)速率

培養(yǎng)7 d后，對(duì)致病力減弱的6個(gè)致病力減弱突變體的生長(zhǎng)速率進(jìn)行測(cè)定(圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6個(gè)致病力減弱突變體T1、T3、T4、T7、T9的生長(zhǎng)速率較快，分別為0.68，0.69，0.68，0.60，0.67 cm/d。與野生型菌株nm-1(0.59 cm/d)相比，差異不顯著(P>0.05)，只有突變體T11生長(zhǎng)速率為0.32 cm/d，與野生型菌株nm-1相比顯著下降(P<0.05)，下降了23.7%。

2.4 致病力減弱突變體的產(chǎn)孢量

培養(yǎng)14 d后，測(cè)定6株致病力減弱突變體的產(chǎn)孢量(圖4)，T1、T3、T4、T7、T9、T11的產(chǎn)孢量分別為0.46×106，0.50×106，1.38×106，1.24×106，0.40×106，0.51×106個(gè)/mL，與野生型菌株nm-1的產(chǎn)孢量(3.84×106個(gè)/mL)相比，都顯著下降(P<0.05)，分別下降了87.9%，87.0%，64.1%，67.8%，89.6%，86.7%。

2.5 致病力減弱突變體Southern Blot 檢測(cè)

利用Southern Blot檢測(cè)突變體菌株(圖5)，6個(gè)突變體的基因組經(jīng)過限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切，與DIG標(biāo)記探針雜交，均只有1個(gè)雜交信號(hào)，說明T-DNA以單拷貝形式插入到各突變體的基因組中。

2.6 致病力減弱突變體側(cè)翼序列分析

利用Hi TAIL-PCR技術(shù)對(duì)6株致病力減弱突變體插入位點(diǎn)的右翼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在第3輪PCR結(jié)束之后，得到了清晰的特異性條帶，大小在200～1 000 bp(圖6)，經(jīng)回收、測(cè)序后，在GenBank上Blast比對(duì)分析，與Leptosphaeriabiglobosa的基因組scaffold 同源性達(dá)95.0%以上，獲得了T-DNA 具體的插入位置(表2)，可以看出，T-DNA的插入位點(diǎn)與scaffold 的長(zhǎng)度和位置沒有聯(lián)系，說明T-DNA 在基因組上的插入是隨機(jī)的。

表2 T-DNA 插入位點(diǎn)序列分析Tab.2 Sequence analysis of T-DNA insertion site

3 討論與結(jié)論

目前，我國(guó)對(duì)于油菜黑脛病的防治，主要通過化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，還沒有黑脛病抗性品種。因此，篩選L.biglobosa致病基因及進(jìn)一步研究L.biglobosa的致病機(jī)制，有助于認(rèn)識(shí)和防治油菜黑脛病的發(fā)生，并為油菜抗黑脛病育種提供一定的理論基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)尚未見有關(guān)L.biglobosa致病機(jī)制的研究報(bào)道，而獲得大量的突變體、鑒定突變體的表型特征、進(jìn)行致病力及插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的分析是病原菌致病機(jī)理研究的最佳方式。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入目的DNA，是篩選突變體的關(guān)鍵技術(shù)[19]，對(duì)插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的擴(kuò)增分析，是致病基因克隆及基因功能研究的基礎(chǔ)[20]。本研究從已建立的L.biglobosa突變體庫(kù)中篩選致病力減弱的突變體，并對(duì)致病力顯著下降的突變體進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)這些突變體的菌落、菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)速率和分生孢子產(chǎn)孢能力出現(xiàn)變化，說明T-DNA插入在一定程度影響著L.biglobosa的生長(zhǎng)發(fā)育，有可能影響了它的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸，這也可能與致病力的減弱有關(guān)，也說明T-DNA 的插入破壞了L.biglobosa致病相關(guān)基因的表達(dá)。這些突變體將為研究L.biglobosa致病相關(guān)基因克隆提供候選條件。

另外，本研究應(yīng)用Hi TAIL-PCR技術(shù)，經(jīng)過3輪PCR，克隆了6個(gè)致病力減弱的右側(cè)翼序列，6個(gè)側(cè)翼序列比對(duì)到L.biglobosabrassicae的scaffold基因組，這6條序列與L.biglobosabrassicae菌株基因組同源性均在95.0%以上。因?yàn)殡m然有L.biglobosabrassicae菌株的全基因組測(cè)序序列，但由于基因組未進(jìn)行注釋，比對(duì)結(jié)果只能獲得T-DNA 插入位點(diǎn)。下一步工作將采用RACE-PCR，根據(jù)側(cè)翼基因片段，克隆L.biglobosa致病力減弱側(cè)翼基因全長(zhǎng)，然后通過基因敲除突變體對(duì)其功能及致病機(jī)理作進(jìn)一步研究。本研究初步明確了T-DNA 插入油菜黑脛病菌L.biglobosa位置。為下一步致病基因的克隆和功能研究奠定了基礎(chǔ)，也為致病機(jī)理的研究提供參考。