賈朝爽，王志華，王文輝，姜云斌

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所，遼寧省果品貯藏加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 興城 125100)

碭山酥梨(PyrusbretschneideriRehd.)屬白梨系統(tǒng)，是我國(guó)栽培面積和產(chǎn)量最大的梨品種，該品種果皮顏色黃亮、果大核小、果肉細(xì)膩、皮薄多汁，是果品中的名優(yōu)產(chǎn)品[1-2]。但碭山酥梨在貯藏后期表皮會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則的黑褐色斑點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)連成片，甚至蔓延到整個(gè)果面，這是一種嚴(yán)重的生理性病害，被稱作黑皮病。黑皮病使果實(shí)的外觀質(zhì)量嚴(yán)重受損，給梨農(nóng)和貯藏企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

近年來，眾多學(xué)者雖對(duì)梨黑皮病的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了深入研究，但至今尚未建立統(tǒng)一的理論。國(guó)內(nèi)外專家普遍認(rèn)為，梨黑皮病發(fā)生機(jī)制與蘋果虎皮病相似，果皮中α-法尼烯及其氧化物代謝產(chǎn)物積累是導(dǎo)致黑皮病發(fā)生的直接原因[4-6]。另外，多酚物質(zhì)的氧化褐變、果實(shí)醇類酯化失調(diào)、自身揮發(fā)物質(zhì)的積累也會(huì)導(dǎo)致黑皮病[7]。目前，關(guān)于梨黑皮病的研究主要集中在α-法尼烯及其氧化物代謝積累、黑皮病發(fā)生的影響因素以及防治等方面，雖有學(xué)者對(duì)黑皮病發(fā)病程度與果實(shí)硬度、可溶性固形物、總酚、過氧化物酶等指標(biāo)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)黑皮病的發(fā)生也會(huì)使總酚含量、多酚氧化酶活性(PPO活性)等相關(guān)生理指標(biāo)失衡[3]，但有關(guān)黑皮病與果實(shí)礦質(zhì)元素、葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)的關(guān)系未見報(bào)道，因此，本研究對(duì)貯藏期不同程度黑皮病的碭山酥梨進(jìn)行相關(guān)特征指標(biāo)測(cè)定，以探索梨黑皮病與相關(guān)生理指標(biāo)的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為碭山酥梨(套袋)果實(shí)，分別于2016年9月21日和2017年9月21日采自山西晉中地區(qū)一管理水平中等的果園，樹齡10 a，采收時(shí)果實(shí)硬度為(5.88±0.16)kg/cm，可溶性固形物含量為(12.95±0.21)%，果實(shí)采收后運(yùn)回中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所(遼寧興城)，選大小均勻、無病蟲害、無機(jī)械傷的果實(shí)放置在(0±1) ℃低溫冷庫(kù)貯藏，待貯藏至第2年4月時(shí)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)調(diào)查和測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑皮病分級(jí)處理 根據(jù)果實(shí)黑皮面積占整個(gè)果實(shí)總面積的百分比分為4級(jí)[8]。0級(jí)：無黑皮現(xiàn)象發(fā)生；Ⅰ級(jí)：黑皮面積≤25%；Ⅱ級(jí)：25%<黑皮面積≤50%；Ⅲ級(jí)：黑皮面積>50%。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 礦質(zhì)元素測(cè)定：碭山酥梨果實(shí)中N含量采用凱氏定氮法測(cè)定，P含量采用鉬銻鈧比色法測(cè)定，K含量采用火焰分光光度法測(cè)定[9]；Ca、Mg含量采用原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定[10]。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次測(cè)定，每個(gè)重復(fù)用果20個(gè)。

呼吸強(qiáng)度采用SP-9890氣相色譜儀(山東，魯南瑞虹儀器有限公司)測(cè)定，參考劉佰霖等[11]方法，載氣為高純N2，壓力為0.5 MPa；燃?xì)鉃榭諝夂蜌錃?，壓力分別為0.4，0.2 MPa；轉(zhuǎn)化爐溫度為360 ℃；填充柱溫度為80 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度為160 ℃。將不同處理果實(shí)分別置于同樣體積密封塑料盒內(nèi)，室溫(20 ℃)密封1 h后，使用注射器抽取1 mL氣體進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)3次，每重復(fù)用果15個(gè)，共計(jì)45個(gè)果。

乙醇含量采用GC-2010氣相色譜儀(日本，島津公司)頂空進(jìn)樣法測(cè)定。測(cè)定具體方法為：載氣為高純N2，壓力為0.5 MPa；燃?xì)鉃榭諝夂蜌錃?，流量分別為400，40 mL/min；FID檢測(cè)器溫度為200 ℃。吸取果實(shí)勻漿上清液5 mL，放入加有NaCl(1.335～1.350 g)及1 mL蒸餾水的頂空瓶?jī)?nèi)，然后混勻進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)處理3次重復(fù)，每重復(fù)用果20個(gè)。

相對(duì)電導(dǎo)率(細(xì)胞膜透性)采用DDS-320電導(dǎo)儀(上海，康儀公司)測(cè)定，參考賈曉輝等[12]方法，稍有改動(dòng)。用10 mm打孔器分別取20片果皮圓片，將其放入燒杯中，然后加50 mL水測(cè)定C0。振蕩30 min后測(cè)定C1。置于沸水中煮30 min，冷卻定容至50 mL，測(cè)定C2。果肉、果心取2 mm厚，其余步驟同果皮。相對(duì)電導(dǎo)率=(C1-C0)/(C2-C0)×100%。

總酚含量和多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定參照高俊鳳[13]的方法，每個(gè)級(jí)別重復(fù)測(cè)定5次，每個(gè)重復(fù)用果9個(gè)。

果皮葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用英國(guó) Hansatech公司的 Handy PEA 葉綠素效率儀測(cè)定，在果實(shí)赤道線兩側(cè)選擇2個(gè)相對(duì)的位點(diǎn)，取直徑約1.5 cm 的果皮，用樣品夾暗處理 30 min，之后依次測(cè)定初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、可變熒光(Fv)、光化學(xué)效率(Fv/Fm)以及PS Ⅱ的潛在活性(Fv/Fo)，測(cè)試光強(qiáng)為3 000 μmol/(m2·s)。每個(gè)級(jí)別重復(fù)測(cè)定3次，每個(gè)重復(fù)用果20個(gè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為2 a試驗(yàn)結(jié)果的平均值，采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，鄧肯氏多重差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 碭山酥梨不同等級(jí)黑皮病果的礦質(zhì)元素含量

不同等級(jí)黑皮病碭山酥梨果實(shí)的主要礦質(zhì)元素含量見圖1。結(jié)果表明，果實(shí)N含量越高，黑皮病越嚴(yán)重，不同等級(jí)果的N元素含量差異顯著(P<0.05)，Ⅰ級(jí)果實(shí)的K、Mg、P含量顯著高于其他級(jí)別(P<0.05)，其中0級(jí)果含量最低。結(jié)果還表明，發(fā)病程度越高的果實(shí)Ca元素含量越低，且各等級(jí)果實(shí)的Ca含量間存在顯著性差異(P<0.05)，0級(jí)果(無黑皮病)的Ca含量最高。

2.2 碭山酥梨不同等級(jí)黑皮病果的呼吸強(qiáng)度和乙醇含量

由圖2可知，對(duì)于呼吸強(qiáng)度來說，0級(jí)果最低，為14.4 mg/(kg·h)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)果和0級(jí)果之間均存在顯著差異(P<0.05)，與0級(jí)果的呼吸強(qiáng)度相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)果的呼吸強(qiáng)度分別提高了15.3%，43.06%，34.03%；同一等級(jí)梨果實(shí)其不同部位的乙醇含量由高到低依次為果皮>果心>果肉，0級(jí)果實(shí)的果皮和果肉乙醇含量均最低，分別為101.34，15.81 mg/kg，二者均顯著(P<0.05)低于Ⅲ級(jí)果實(shí)的果皮和果肉，且果皮乙醇含量也顯著低于Ⅰ、Ⅱ級(jí)果實(shí)的果皮；0級(jí)果心的乙醇含量最高，為97.29 mg/kg，顯著(P<0.05)高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)果心的乙醇含量。

2.3 碭山酥梨不同等級(jí)黑皮病果的相對(duì)電導(dǎo)率

由圖3可知，同一等級(jí)梨果實(shí)其不同部位的相對(duì)電導(dǎo)率(細(xì)胞膜透性)由高到低依次為果肉>果心>果皮，0級(jí)果的果皮、果肉和果心相對(duì)電導(dǎo)率均最低，分別為13.10%，52.36%，32.78%，且均顯著(P<0.05)低于Ⅱ、Ⅲ級(jí)果，且果肉相對(duì)電導(dǎo)率也顯著低于Ⅰ級(jí)果。可以看出，黑皮病越嚴(yán)重，果肉相對(duì)電導(dǎo)率越高，表明細(xì)胞膜損傷越嚴(yán)重，果皮和果心相對(duì)電導(dǎo)率在0級(jí)果與Ⅰ級(jí)病果間無顯著差異(P>0.05)。

2.4 碭山酥梨不同等級(jí)黑皮病果的總酚含量和PPO活性

由圖4可知，同一等級(jí)梨果實(shí)不同部位的總酚含量由高到低依次為果皮>果心>果肉，0級(jí)果的總酚含量最低，其中0級(jí)果皮、果心總酚含量與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)果均存在顯著差異(P<0.05)，0級(jí)果肉總酚含量與Ⅰ級(jí)果存在顯著差異(P<0.05)，與Ⅱ、Ⅲ級(jí)果均無顯著差異(P>0.05)；與相對(duì)電導(dǎo)率規(guī)律一致，發(fā)病程度越高的果實(shí)其果皮、果肉、果心PPO活性越高，除0級(jí)果外，其他等級(jí)梨果實(shí)其不同部位的PPO活性由高到低依次為果心>果皮>果肉，且各等級(jí)果實(shí)果皮、果肉和果心的PPO活性之間均存在顯著差異(P<0.05)，Ⅲ級(jí)果3個(gè)部位的PPO活性均顯著(P<0.05)高于0、Ⅰ、Ⅱ級(jí)果。

2.5 碭山酥梨不同等級(jí)黑皮病果的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

由圖5可知，無黑皮病(0級(jí))果實(shí)的葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)(Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo)均顯著(P<0.05)高于發(fā)病果(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí))，表明黑皮病的果實(shí)衰老或者受逆境脅迫較嚴(yán)重。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)果之間Fo、Fm、Fv、Fv/Fo差異顯著(P<0.05)，而Ⅱ級(jí)與Ⅰ級(jí)果之間Fv/Fm值差異不顯著(P>0.05)。

2.6 碭山酥梨不同等級(jí)黑皮病與相關(guān)生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

為明確碭山酥梨的發(fā)病程度與果實(shí)相關(guān)生理指標(biāo)間的相互關(guān)系，以黑皮病不同等級(jí)為一個(gè)總體，以對(duì)應(yīng)的相關(guān)生理指標(biāo)數(shù)據(jù)為另一個(gè)總體，應(yīng)用典型相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由表1可知，黑皮病等級(jí)與N含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，其相關(guān)系數(shù)為0.987；而與Ca含量間呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，其相關(guān)系數(shù)為-0.991。黑皮病的等級(jí)與呼吸強(qiáng)度、乙醇含量(果皮)、電導(dǎo)率(果肉)、總酚含量(果皮和果心)、PPO活性(果皮、果肉、果心)均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.870，0.784，0.986，0.805，0.853，0.924，0.996，0.976；與果肉乙醇含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其相關(guān)系數(shù)為0.684；而與果心乙醇含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，其相關(guān)系數(shù)為-0.790。黑皮病的等級(jí)與Fo、Fm值呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.977，-0.941；與Fv值呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，其相關(guān)系數(shù)為-0.673；與Fv/Fm、Fv/Fo呈負(fù)相關(guān)，但并不顯著。

表1 果實(shí)生理指標(biāo)與黑皮病等級(jí)的相關(guān)系數(shù)Tab.1 Correlation coefficient between the physiological index and the superficial scald grade of fruit

3 討論與結(jié)論

碭山酥梨貯藏后期果實(shí)發(fā)生黑皮病的幾率很高，嚴(yán)重影響果實(shí)的外觀和商品價(jià)值，易造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì)梨黑皮病的發(fā)病機(jī)制至今不明，Isidoro等[6]在Rocha梨與Spotts等[14]在Anjou梨中的研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時(shí)間的增加，共軛三烯呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)，而α-法尼烯的含量在貯藏前期呈上升趨勢(shì)，但在貯藏后期則不斷下降，因此，專家普遍認(rèn)為是α-法尼烯和其氧化產(chǎn)物的積累導(dǎo)致黑皮病的發(fā)生，同時(shí)黑皮病的發(fā)生導(dǎo)致總酚含量、PPO活性等相關(guān)生理指標(biāo)失衡，初步判斷黑皮病發(fā)生可能還與其他因素有緊密聯(lián)系，本研究對(duì)此進(jìn)行了詳細(xì)研究。

鈣元素是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，其在植物內(nèi)含量一般為0.1%～5.0%[15]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，黑皮病發(fā)病程度與果實(shí)中的Ca含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明碭山酥梨果實(shí)黑皮病的發(fā)生與果實(shí)中的Ca含量密切相關(guān)。本研究還表明，碭山酥梨黑皮病果實(shí)中的N、K、Mg、P含量均高于正常果實(shí)，其中N含量隨著黑皮病發(fā)病程度的增加逐漸升高，初步判斷，果實(shí)中較高的N含量和相對(duì)低的Ca含量可能是導(dǎo)致碭山酥梨果實(shí)貯藏后期出現(xiàn)黑皮病的主要原因，這與前人研究果實(shí)單一性缺鈣不一定會(huì)導(dǎo)致黑皮病發(fā)生，過高的氮含量和鉀含量會(huì)對(duì)鈣的吸收產(chǎn)生較強(qiáng)的拮抗作用的結(jié)論具有一致性[16-17]。本結(jié)論是在2 a重復(fù)研究的基礎(chǔ)上得出的，雖然進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)，但樣本采自同一果園，下一步需要擴(kuò)大采集規(guī)模，從不同管理水平的多個(gè)果園進(jìn)行測(cè)定比較，進(jìn)一步驗(yàn)證。

還有研究表明，黑皮病與乙烯作用有一定相關(guān)性，α-法尼烯的合成是乙烯通過結(jié)合受體加快完成的，所以果實(shí)的呼吸強(qiáng)度對(duì)黑皮病的發(fā)生有一定的影響[18]，本試驗(yàn)也表明，隨著碭山酥梨果實(shí)黑皮病發(fā)病程度的增加，其呼吸強(qiáng)度也呈上升趨勢(shì)，初步判斷黑皮現(xiàn)象逐漸加重可能與呼吸強(qiáng)度較高有一定關(guān)系。此外本研究通過對(duì)碭山酥梨果皮、果肉和果心不同部位的乙醇含量進(jìn)行測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)隨著黑皮病加重，果皮和果肉部位的乙醇含量增加，果心部位含量下降，可以看出同一果實(shí)不同部位發(fā)生黑皮病之后，對(duì)乙醇含量的影響存在差異，也同樣證明了研究果實(shí)自身揮發(fā)性物質(zhì)的致病理論具有一定的困難。這與Prasad和Meigh等[19-20]認(rèn)為黑皮病的發(fā)生可能是由自身揮發(fā)性物質(zhì)所引起，但未發(fā)現(xiàn)果實(shí)內(nèi)醇、酯含量與黑皮病發(fā)生的相關(guān)性且致病理論無法進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)論具有一致性。

Rowan和Rupasinghe等[21-22]研究表明，黑皮病產(chǎn)生是由于細(xì)胞內(nèi)部α-法尼烯氧化生成共軛三烯，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起果皮組織氧化褐變，最終導(dǎo)致表皮層細(xì)胞大量死亡。與上述結(jié)論一致，本試驗(yàn)中黑皮病等級(jí)與果肉部位的相對(duì)電導(dǎo)率呈極顯著正相關(guān)，說明果實(shí)黑皮病發(fā)生與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)破壞具有密切關(guān)系。而果皮部位的相對(duì)電導(dǎo)率與黑皮病等級(jí)存在一定正相關(guān)(r=0.383)，但相關(guān)性并不顯著，這可能是因?yàn)樵诠麑?shí)發(fā)病初期只是果實(shí)的亞表皮的外層細(xì)胞輕微褐變，隨著黑皮病加重，亞表皮細(xì)胞褐變程度增加，并向里擴(kuò)展到5～6層亞表皮細(xì)胞，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使亞表皮細(xì)胞解體，內(nèi)鄰的皮層細(xì)胞變形，導(dǎo)致果皮凹陷，而表皮細(xì)胞一般不受影響[23-24]。果皮相對(duì)電導(dǎo)率取樣及測(cè)定可能主要以果皮表皮細(xì)胞為主，而果肉相對(duì)電導(dǎo)率取樣及測(cè)定則是鄰近果皮部位的果肉，大多含有果皮內(nèi)鄰的皮層細(xì)胞，后期應(yīng)對(duì)果皮相對(duì)電導(dǎo)率和果肉相對(duì)電導(dǎo)率與黑皮病發(fā)生的機(jī)制進(jìn)行深入研究。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑皮病等級(jí)與果皮、果心總酚含量以及3個(gè)部位的PPO活性均呈顯著正相關(guān)，與鞠志國(guó)[25]發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)含量與黑皮病發(fā)生過程存在聯(lián)系的結(jié)果一致。

Mir等[26]研究不同品種蘋果虎皮病與葉綠素?zé)晒鈪?shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Fv/Fm值由0.78下降到0.70時(shí)，果實(shí)表面會(huì)出現(xiàn)病斑，表明Fv/Fm值可以反映虎皮病的發(fā)展?fàn)顩r。與以上研究結(jié)果類似但又存在差別，碭山酥梨果實(shí)的Fv/Fm值與黑皮病等級(jí)呈不顯著負(fù)相關(guān)，但總體而言，無黑皮病果的Fv/Fm值高于黑皮病果，在一定程度上表明黑皮病等級(jí)與Fv/Fm值的降低有關(guān)，但卻不能完全取決于Fv/Fm值下降的程度，這可能由于果實(shí)的品種、貯藏環(huán)境等存在差異，因而對(duì)果實(shí)Fv/Fm值的變化趨勢(shì)產(chǎn)生了影響。

本研究結(jié)果表明，黑皮病的發(fā)生和礦質(zhì)元素失調(diào)(Ca含量降低，N含量升高)有著緊密的聯(lián)系，在今后工作中應(yīng)探尋解決礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)失衡的問題，從而指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)中準(zhǔn)確平衡施肥，降低果實(shí)貯藏期黑皮病的發(fā)生。同時(shí)黑皮病發(fā)病程度的增加，將會(huì)使果實(shí)的呼吸強(qiáng)度、乙醇含量(果皮)、相對(duì)電導(dǎo)率(果肉)、總酚含量(果皮、果心)、PPO活性(果皮、果肉、果心)逐漸增強(qiáng)，果皮葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fm、Fo)逐漸降低。因此，可通過采前調(diào)控礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素或采后補(bǔ)鈣等手段，降低果實(shí)貯藏期黑皮病發(fā)生，從而提高果實(shí)貯藏品質(zhì)。