李 娟，王 利，羅曉林，官久強

(1.西南民族大學，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部和四川省重點實驗室，四川 成都 610041；2.四川省草原科學研究院，四川 成都 611731)

水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)參與細胞水液平衡的調(diào)節(jié)，在跨細胞膜轉(zhuǎn)運過程中起著重要的作用[1]。目前已發(fā)現(xiàn)13個AQP家族成員AQP0～12[2]，其對水都有通透性，由于基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)和組織分布等不同導致家族成員在機體中起著不同的作用[3]。AQP8對水分子具有高度的選擇性[4]，可作為B細胞活化過程的信號調(diào)節(jié)劑，在幾種類型的B細胞相關(guān)疾病中表達[5-6]，還參與了宮頸癌、直腸癌和急性肝損傷等多類疾病的發(fā)生[7-9]。此外，AQP8在肝臟細胞內(nèi)對水通透，還對過氧化氫、氨也有通透性[10-11]，其存在于運輸囊泡和管狀質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域和線粒體內(nèi)膜中，是膽汁的合成、分泌和調(diào)節(jié)[12-13]以及參與糖原代謝過程中對細胞滲透壓的保持和對線粒體體積的維持等功能的基礎(chǔ)[14]。目前，關(guān)于AQP8基因表達僅在人、鼠、水牛等哺乳動物中有報道[15-17]，在高原動物中未見報道。牦牛作為以我國青藏高原為中心的高原特有珍稀牛種之一，對其生態(tài)環(huán)境具有極強適應(yīng)性[18]，對AQP8基因的研究為探討牦牛極端環(huán)境適應(yīng)性具有重要意義。本研究旨在克隆牦牛AQP8，并對不同年齡段肝臟中該基因的差異表達進行分析，為深入研究牦牛AQP8基因功能提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及樣品采集

試驗動物源于四川省阿壩州紅原縣，隨機選取健康胎兒(1 d)、幼年(15月)、成年(5歲)雌性麥洼牦牛各3頭，屠宰后采集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉、瘤胃組織樣品，部分液氮保存，部分4%多聚甲醛進行固定。

1.2 主要試劑

4%多聚甲醛固定液購自國藥集團化學試劑有限公司；AQP8兔多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；組化二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ酶、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、DL2000 Marker和DH5α感受態(tài)細胞均購于寶生物工程 (大連)有限公司；1.1×T3 Super PCR購自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。

1.3 RNA提取及cDNA合成

用TRIzol法對牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉、瘤胃8種組織進行RNA提取，通過1%瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA質(zhì)量及完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 牦牛AQP8基因克隆及測序

根據(jù)GenBank上公布的牛AQP8基因序列(登錄號：NM_001206607．3)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計CDS區(qū)擴增引物，引物序列上游：5′-ATGTTTACAGA

GGCAGCTGTATCCA-3′；下游：5′-TCACCGTCCCTTTA

GGATTAGACGA-3′。PCR擴增反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，上下游引物各2 μL，1.1×T3 Super PCR Mix 44 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測后按膠回收試劑盒說明書對其進行膠回收，并按pMDTM19-T克隆載體試劑盒說明書將目的基因與載體16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，37 ℃進行培養(yǎng)40 min進行復蘇，均勻的涂布到含有Amp+的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落進行PCR鑒定，陽性菌液送上海生物工程有限公司進行測序。

1.5 牦牛AQP8基因生物信息學分析

用NCBI中的Blast對獲得的核酸序列進行比對，并用ORF Finder獲得其氨基酸序列，用在線軟件ExPASy中的ProtParam進行蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析；ProtScal進行疏水性分析；用在線軟件TMHMM對蛋白進行跨膜分析；SignalP對信號肽進行分析；用在線軟件SMART對蛋白的結(jié)構(gòu)功能域進行分析；用在線軟件SOPMA、SWISS-MODEL對蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進行預測；用MEGA 6.0軟件進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 牦牛AQP8基因組織表達譜及不同生長階段肝臟中的表達檢測

以β-actin為內(nèi)參基因，采取qRT-PCR方法檢測AQP8基因在成年麥洼牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉和瘤胃共8種組織中的表達量。并且檢測1 d、15月、5歲麥洼牦牛肝臟中的AQP8基因表達量。β-actin引物為上游：5′-CTTCGAGCAG

GAGATGGC-3′；下游：5′-CCGTGTTGGCGTAGAGGT-3′。AQP8引物為上游：5′-CAGCGTCAAGGTGAAGGAG-3′；下游：5′-GAAGATGAACAGAGCAGAGCC-3′。反應(yīng)體系：上下游引物均為0.8 μL，cDNA模板1 μL，TB GreenTMPremix Ex TaqTM5.2 μL，滅菌ddH2O 2.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，59.4 ℃退火10 s，共40個循環(huán)。以牦牛β-actin為內(nèi)參基因?qū)M織進行定量結(jié)果分析，得到每個樣品的 Ct 值，每個樣品3個生物學重復，3個技術(shù)重復。采用2-ΔΔCt法分析試驗結(jié)果，數(shù)據(jù)用平均值±標準誤差，SPSS 24.0 單因素方差分析其顯著性，P<0.05表示差異性顯著，P>0.05差異性不顯著。

1.7 牦牛AQP8蛋白免疫組織化學檢測

對4%多聚甲醛固定的1 d、15月、5歲牦牛段肝臟組織進行包埋、切片和染色，用枸櫞酸緩沖液(pH值6.0)進行抗原修復，加入阻斷劑后PBS清洗，滴加100 μL或適量的封閉用正常山羊血清工作液孵育后，滴加一抗(1∶100)，4 ℃過夜孵育后滴加二抗，DAB進行顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察陽性表達情況，顯微成像系統(tǒng)拍照記錄，每個樣品選擇3個陽性區(qū)域進行拍照，用Image Pro Plus 6.0 軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行光密度分析，SPSS 24.0分析其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛AQP8基因的克隆

以牦牛肝臟cDNA為模板，PCR擴增牦牛AQP8基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得單一的目的條帶，如圖1所示。經(jīng)測序獲得一條長為792 bp的序列，ORF為792 bp，編碼263個氨基酸，序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MT062952。

2.2 牦牛AQP8基因生物信息學分析

將獲得的麥洼牦牛AQP8基因核酸序列與其他物種進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)其與野牦牛的核苷酸序列同源性最高為99.6%，其次與水牛、山羊和綿羊的同源性分別為98.6%，98.2%，98.1%。同時構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)其與野牦牛的親緣關(guān)系最近，與小斑熊蟲的親緣關(guān)系最遠，并且該基因在物種進化過程中有較高的保守性(圖2)。

通過對AQP8蛋白進行理化性質(zhì)分析所知，該蛋白的分子式為C1271H2001N327O340S15，分子質(zhì)量為27.78 ku，理論等電點為6.50，帶負電殘基數(shù)(Asp+Glu)17，帶正電殘基數(shù)(Arg+Lys)16，脂肪系數(shù)114.64，半衰期30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為34.04，推測該蛋白為酸性穩(wěn)定蛋白。該蛋白中，亮氨酸的含量最高為13.7%，酪氨酸的含量最低為1.5%。功能預測發(fā)現(xiàn)，該蛋白是典型的疏水蛋白，有6個跨膜螺旋區(qū)，在33-247有1個高度保守的MIP結(jié)構(gòu)功能域。該蛋白二級結(jié)構(gòu)有α螺旋、β折疊、無規(guī)卷曲，分別占比為41.8%，6.08%，18.87%，34.22%，其三級結(jié)構(gòu)由26-252位氨基酸構(gòu)成。

2.3 牦牛AQP8基因的組織表達譜

不同組織提取的RNA經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰完整無降解，利用Nanodrop檢測RNA的純度和濃度，其A260/280nm比值均在1.8～2.2，表明RNA質(zhì)量符合試驗要求，可以進行后續(xù)試驗。采用qRT-PCR檢測AQP8基因在成年麥洼牦牛8種組織中的表達量，以心臟為參照，AQP8基因在成年麥洼牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉和瘤胃共8種組織中均有表達，其中在肝臟中的表達最高，且顯著高于心臟、脾臟和腎臟等其他組織(P<0.05)，其他組織之間表達不顯著(P>0.05)(圖3)。

2.4 AQP8基因在牦牛不同生長階段肝臟中mRNA表達

對牦牛胎兒時期(1 d)、幼年時期(15月)和成年時期(5歲)肝臟中AQP8的表達量進行分析，結(jié)果顯示，幼年時期的牦牛肝臟中AQP8的表達量最高，顯著高于胎兒時期和成年時期(P<0.05)，其次為成年時期和胎兒時期，AQP8在胎兒時期和成年時期中表達差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

2.5 AQP8蛋白在牦牛肝臟組織的定位和表達

對牦牛不同生長階段的肝臟進行免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)，在胎兒時期、幼年時期和成年時期牦牛肝臟組織中，均有AQP8蛋白表達，AQP8蛋白主要表達于肝細胞的細胞質(zhì)中，細胞上呈黃色或棕黃色(圖5)。對其平均光密度值分析發(fā)現(xiàn)，AQP8蛋白在幼年(15月)牦牛肝臟中的表達量最高，成年(5歲)次之，胎兒(1 d)時期最低，且幼年(15月)和成年(5歲)時期的表達顯著高于胎兒時期(P<0.05)，幼年和成年時期的表達沒有顯著差異(P>0.05)(圖6)。

3 討論與結(jié)論

水通道蛋白位于細胞膜上調(diào)節(jié)水液的平衡，水液平衡的失調(diào)會導致相關(guān)疾病的發(fā)生[19-20]，其研究有利于目前對疾病的研究和治療。牦牛作為高原最大哺乳動物，對高原低氧環(huán)境具有適應(yīng)性，對AQP8基因的探究有利于進一步了解水通道蛋白家族與牦牛低氧適應(yīng)性之間的關(guān)系。目前已有AQP1[21]、AQP4[22-23]、AQP9[24-25]與低氧環(huán)境相關(guān)的報道。為探討AQPs基因在低氧環(huán)境中的功能，本試驗克隆了牦牛AQP8基因，發(fā)現(xiàn)該基因在進化過程中相對保守，其與李勝等[17]克隆到的水牛AQP8基因相差60 bp，這可能是由于物種之間的差異導致的。對AQP8蛋白結(jié)構(gòu)域進行預測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有一個AQPs特有的穩(wěn)定MIP結(jié)構(gòu)域，是形成膜通道的重要結(jié)構(gòu)，與水牛相比少一個MIP結(jié)構(gòu)域，這可能是由于牦牛生活在高原環(huán)境所導致的。牦牛AQP8蛋白結(jié)構(gòu)預測為進一步探討該蛋白在牦牛上的功能作用提供了參考資料。

本試驗采用qRT-PCR方法檢測到AQP8基因在牦牛肝臟中特異性高表達，說明AQP8主要存在于肝細胞中。張霖等[9]報道AQP8是在人肝細胞中大量表達且起重要作用的水通道蛋白，人AQP8在肝臟中高表達與其參與肝臟中的代謝活動相關(guān)，且AQP8的表達異常會導致肝細胞通透性改變和水液代謝的失衡[4]。肝臟中水液代謝影響著線粒體的能量代謝[26]，AQP8在肝臟線粒體中高表達，可促進氧化磷酸化和細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導以及線粒體體積調(diào)控[10，27]。肝臟作為牦牛體內(nèi)的一個重要能量代謝器官，維持和穩(wěn)定機體氧化功能[28]，對適應(yīng)高原極端環(huán)境有重要作用。組織定位發(fā)現(xiàn)，AQP8蛋白主要于肝細胞的細胞質(zhì)中表達，由此推測AQP8在牦牛肝臟中特異性高表達可能與其在低氧環(huán)境下參與機體的能量代謝相關(guān)。AQP8蛋白與AQP8基因表達有一定的差異，可能是由于mRNA降解、蛋白折疊與修飾等因素導致的。在生長發(fā)育的胎兒時期、幼年時期和成年時期，肝臟的代謝功能有一定的差異。賴樹云等[29]報道的不同年齡組小鼠肝細胞線粒體的差異分析表明幼年組的肝細胞線粒體密度極顯著高于成年組。幼年時期麥洼牦牛肝臟中AQP8的表達顯著高于胎兒時期和成年時期，不同年齡段的差異表達可能與肝細胞線粒體密度相關(guān)。通過免疫組化檢測到牦牛AQP8蛋白定位在肝細胞的細胞質(zhì)中，從而可以推測牦牛AQP8可能通過調(diào)控細胞質(zhì)中的線粒體參與機體的能量代謝。

本試驗成功克隆了牦牛AQP8基因，發(fā)現(xiàn)該基因在牦牛肝臟中高表達，幼年時期肝臟中AQP8基因表達顯著高于胎兒時期和成年時期，且AQP8蛋白主要定位在肝細胞的細胞質(zhì)中，在幼年牦牛肝臟中的表達量最高，這表明牦牛AQP8在肝臟能量代謝過程中發(fā)揮著一定作用，為深入探討牦牛AQP8功能以及牦牛低氧適應(yīng)性機制積累了科學資料。