代曉朋，宋 兵，牛霄英，焦艷梅，陶維光，吳逢英，蓋麗娜，崔 澂

HBV感染是人類最常見的慢性傳染病，是全球性的公共衛(wèi)生問題。目前全世界范圍內(nèi)大約有2.92億HBV攜帶者，每年有近90萬人死于HBV相關(guān)的并發(fā)癥[1]。HBV感染是慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌的關(guān)鍵危險因素，HBV在宿主體內(nèi)復制和表達是HBV相關(guān)并發(fā)癥的主要原因。HBV與宿主之間存在復雜的相互作用，深入了解HBV在宿主體內(nèi)的復制和表達的分子機制，有利于進一步闡明HBV致病機制并為抗HBV藥物研發(fā)和改進提供新的思路。

微小RNAs（microRNAs,miRNAs）是病毒與宿主相互作用的一類新的調(diào)控分子[2-3]。miRNAs是由19～23個核苷酸組成的小的非編碼RNA，通過與目標轉(zhuǎn)錄本的3′非編碼區(qū)（untraslated regions,UTR）配對，抑制mRNA翻譯和/或降解mRNA，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用[4]。miRNAs與HBV之間存在著多方面的相互作用。一方面，HBV調(diào)節(jié)宿主細胞miRNAs的表達，增強自身復制能力，逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視，從而使病毒在受感染的肝細胞中持續(xù)增殖[5]；另一方面，宿主miRNAs能調(diào)控HBV的復制和表達，miRNAs可以通過與HBV轉(zhuǎn)錄本直接結(jié)合影響HBV復制，也可以通過靶向與HBV生命周期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子間接影響HBV復制[6]。此外，miRNAs還參與調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導通路中的相關(guān)基因，在HBV致病中發(fā)揮重要作用。

前期為了探索miRNAs在 HBV復制中的作用及分子機制，分別以HepG2、HepG2.2.15、HepAd38作為無 HBV復制細胞模型、HBV低復制細胞模型、HBV高復制細胞模型，進行miRNAs芯片檢測，分析3種細胞模型miRNAs表達譜，發(fā)現(xiàn)miRNA-582-5p （miR-582-5p）表達水平與HBV復制水平呈負相關(guān)[7]。本研究以miR-582-5p為研究對象，探究其在HBV復制和表達中的作用及其調(diào)控機制。具體報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 Huh7、HepG2、HepG2.2.15、HepAd38細胞系由研究室留存。pGL3-S1 promoter、pGL3-S2 promoter、pGL3-Core promoter、pGL3-EnhancerⅠ等報告基因質(zhì)粒，pcDNA3.1-HBx、pcDNA3.1-HBP、pcDNA3.1-HBLS、pcDNA3.1-HBP等HBV蛋白表達質(zhì)粒由本研究室留存[6]。miR-582-5p mimics、miR-582-5p inhibitor及其無關(guān)序列陰性對照（negative control,NC）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；RPMI Medium 1640 basic、DMEM basic、胎牛血清、Lipofectamine 2000、TRIzol Reagent（invitrogen）購自上海立菲生物技術(shù)有限公司；rTaq DNA聚合酶、dNTP 等購自TaKaRa公司；HBsAg診斷試劑盒、HBeAg檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司； HBV核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）購自凱杰生物工程（深圳）有限公司；GoScript Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Go Taq qPCR Master Mix定量檢測試劑盒購自Promega公司。質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2、Huh7。含380 μg/ml G418的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng) HepG2.2.15、HepAD38。細胞在含 5%CO2的37 ℃孵箱中進行培養(yǎng)。用胰酶消化細胞，計數(shù)后鋪板，待細胞生長到90%～95%融合度時使用Lipofectamine 2000 按照說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 實時定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）檢測miRNA、mRNA和HBV DNA 用TRIzol Reagent（invitrogen）按說明書提取細胞內(nèi)總RNA。根據(jù)GoScript Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后根據(jù)Go Taq qPCR Master Mix定量檢測試劑盒說明書，取2 μl反轉(zhuǎn)錄的cDNA，分別以U6 snRNA和β-actin為miRNA和mRNA檢測內(nèi)參，檢測miR-582-5p、HBV mRNA和NOTCH1 mRNA表達水平（反轉(zhuǎn)錄及定量檢測引物見表1）。定量PCR 儀上反應(yīng)程序：95 ℃，2 min； 95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，40循環(huán)；熔解曲線。用2-△△Ct法計算相對表達量[8]。HBV DNA檢測按照HBV核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書進行。

表1 引物及序列Table 1 Primers and sequences

1.2.3 ELISA檢測HBsAg和HBeAg 根據(jù)HBsAg診斷試劑盒、HBeAg檢測試劑盒操作說明書進行操作。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 收集細胞，加入預冷RIPA裂解緩沖液處理10～20 min以裂解細胞，離心去除細胞碎片，加入上樣緩沖液煮沸10 min后上樣。在SDS-PAGE中進行電泳，電泳結(jié)束后使用半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST洗膜液漂洗，5%的牛奶封閉1 h。將NOTCH1一抗稀釋（1∶500稀釋）后室溫下輕搖孵育1 h，4 ℃靜置過夜。洗滌后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h。二抗孵育結(jié)束后洗膜液清洗5次，用增強化學發(fā)光法顯色。

1.2.5 靶基因預測 本研究中使用3個網(wǎng)站進行 miR-582-5p靶 基 因 預 測：TargetScan （http://www.targetscan.org/）、Pictar（http://pictar.bio.nqyu.edu/）和 MiRanda （http://microrna.sanger.ac.uk/）。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測 雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。將基因表達質(zhì)粒、報告基因質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒組合后轉(zhuǎn)染Huh7細胞，48 h后收集細胞，加入Passive Lysis Buffer裂解細胞，離心去除細胞碎片。用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega）進行報告基因檢測。RLU1為螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度，RLU2為內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度，計算Ratio=RLU1/RLU2。

1.3 統(tǒng)計學處理 每個實驗至少重復3次，應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用±s表示。2組熒光素酶相對活性、mRNA和miRNA表達水平的比較采用成組t檢驗，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-582-5p對HBV復制和表達的影響

2.1.1 過表達miR-582-5p抑制HBV復制和表達 本研究室之前通過miRNAs芯片檢測HepG2、HepG2.2.15、HepAd38 3種細胞miRNAs表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-582-5p表達水平隨著HBV復制水平升高而降低。進一步通過qRT-PCR驗證HepG2、HepG2.2.15、HepAd38 3種細胞miR-582-5p的表達水平，結(jié)果如圖1A所示，與芯片結(jié)果一致，隨著HBV表達水平升高，miR-582-5p的表達逐漸降低，提示miR-582-5p可能參與HBV的復制和表達。

首先分析過表達miR-582-5p對HBV復制和表達的影響。將miR-582-5p mimics與pHBV1.2共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞，qRT-PCR檢測細胞上清HBV DNA，結(jié)果如圖1B所示，miR-582-5p使細胞分泌到上清中的HBV DNA水平降低，提示miR-582-5p表達抑制了HBV復制；qRT-PCR檢測細胞內(nèi)HBV RNA，結(jié)果如圖1C所示，miR-582-5p使細胞內(nèi)HBV RNA水平降低，提示miR-582-5p表達抑制了HBV轉(zhuǎn)錄；ELISA法檢測細胞上清HBeAg和HBsAg，結(jié)果如圖1D、E所示，miR-582-5p使細胞分泌到上清中的HBeAg和HBsAg降低，提示miR-582-5p表達抑制了HBV蛋白表達。以上結(jié)果表明，miR-582-5p過表達能抑制HBV復制和表達。

圖1 過表達miR-582-5p抑制HBV復制和表達A.3種細胞HepG2、HepG2.2.15、HepAd38 miR-582-5p的相對表達量檢測（3組兩兩比較，P均＜0.05）；B～E.miR-582-5p mimics與pHBV1.2共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞，HBV相關(guān)指標監(jiān)測，HBV DNA（B）、HBV RNA（C）、HBeAg（D）、HBsAg（E）Figure 1 Overexpression of miR-582-5p inhibits HBV replication and expression

2.1.2 抑制內(nèi)源性miR-582-5p表達能促進HBV復制和表達 進一步分析抑制內(nèi)源性miR-582-5p表達對HBV復制和表達的影響。將miR-582-5p inhibitor與pHBV1.2共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞，qRT-PCR檢測細胞上清HBV DNA，結(jié)果如圖2A所示，抑制內(nèi)源性miR-582-5p表達使細胞分泌到上清中的HBV DNA水平升高，提示抑制內(nèi)源性miR-582-5p表達促進了HBV復制；qRT-PCR檢測細胞內(nèi)HBV RNA，結(jié)果如圖2B所示，抑制內(nèi)源性miR-582-5p表達使細胞內(nèi)HBV RNA水平升高，提示抑制內(nèi)源性miR-582-5p表達促進了HBV轉(zhuǎn)錄；ELISA法檢測細胞上清HBeAg和HBsAg，結(jié)果如圖2C、D所示，抑制內(nèi)源性miR-582-5p表達使細胞分泌到上清中的HBeAg和HBsAg水平升高，提示抑制內(nèi)源性miR-582-5p表達促進了HBV蛋白表達。以上結(jié)果表明，抑制內(nèi)源性miR-582-5p表達能促進HBV復制和表達。

圖2 抑制內(nèi)源性miR-582-5p表達促進HBV復制和表達A～D.miR-582-5p inhibitor與pHBV1.2共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞，HBV相關(guān)指標監(jiān)測，HBV DNA（A）、HBV RNA（B）、HBeAg（C）、HBsAg（D）Figure 2 Downregulation of endogenous miR-582-5p expression promotes HBV replication and expression

2.2 miR-582-5p調(diào)控HBV表達和復制的分子機制

2.2.1 miR-582-5p抑制HBV啟動子和增強子活性 miRNA能通過直接與HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相互作用，或者通過靶向HBV生命周期相關(guān)的重要細胞因子從而間接調(diào)控HBV復制和表達。通過生物信息學分析，排除了miR-582-5p與HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的直接結(jié)合。當HBV感染肝細胞后，基因組被釋放到肝細胞核中，松弛環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)化為共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circle,cccDNA），cccDNA合成以及以cccDNA為模板進行的基因轉(zhuǎn)錄是HBV復制和表達的重要環(huán)節(jié)，在這一過程中，HBV啟動子與增強子等調(diào)控元件發(fā)揮重要作用。

分析miR-582-5p對HBV啟動子和增強子的影響。將miR-582-5p mimics分別與pGL3-S1 promoter（S1p）、pGL3-S2 promoter（S2p）、pGL3-Core promoter（Cp）、pGL3-EhancerⅠ組合轉(zhuǎn)染 Huh7細胞，雙熒光素酶報告基因檢測相對活性，結(jié)果如圖3A所示。miR-582-5p抑制了HBV S2 promoter和HBV EhancerⅠ活性，提示miR-582-5p可能通過抑制HBV S2 promoter和HBV EhancerⅠ的活性從而抑制HBV復制和表達。

2.2.2 miR-582-5p對HBV促進因子NOTCH1的影響 miR-582-5p不能直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，提示miR-582-5p可能通過靶向抑制HBV復制和表達的正調(diào)控分子，從而間接抑制HBV復制與表達。該靶基因分子應(yīng)滿足以下兩個條件：①該分子3′UTR能與 miR-582-5p互補配對；②該分子是HBV復制與表達的正調(diào)控分子。通過TargetScan，PicTar和MiRanda預測，結(jié)合文獻調(diào)研，發(fā)現(xiàn)NOTCH1分子同時滿足以上兩個條件，結(jié)果如圖3B所示，miR-582-5p能直接靶向NOTCH1 3′UTR的1558—1564位。

分析miR-582-5p對NOTCH1的影響。首先分析miR-582-5p是否可以直接結(jié)合NOTCH1 3′UTR。將 miR-582-5p mimics與 pGL3-NOTCH1 3′UTR組合轉(zhuǎn)染Huh7細胞，雙熒光素酶報告基因檢測相對活性，結(jié)果如圖3C所示，miR-582-5p抑制了pGL3-NOTCH1 3′UTR報告基因活性。進一步分析miR-582-5p對NOTCH1復制和表達的影響，將miR-582-5p mimics轉(zhuǎn)染Huh7細胞，qRTPCR檢測NOTCH1 mRNA表達，Western blot 檢測NOTCH1蛋白表達，檢測結(jié)果如圖3D、E所示，miR-582-5p使NOTCH1 mRNA和蛋白表達水平降低，提示miR-582-5p表達抑制了NOTCH1轉(zhuǎn)錄和翻譯。以上結(jié)果表明，miR-582-5p能直接靶向并抑制NOTCH1表達。

圖3 miR-582-5p抑制HBV啟動子和增強子活性，并靶向抑制NOTCH1表達A.將miR-582-5p分別與HBV啟動子和增強子報告基因載體組合轉(zhuǎn)染Huh7細胞，熒光素酶報告基因檢測相對活性；B.miR-582-5p與NOTCH1 3′UTR的1558-1564位直接結(jié)合；C.將miR-582-5p與NOTCH1 3′UTR報告基因載體組合轉(zhuǎn)染Huh7細胞，熒光素酶報告基因檢測相對活性；D～E.將miR-582-5p轉(zhuǎn)染Huh7細胞，qRT-PCR檢測NOTCH1 mRNA表達（D），Western blot檢測NOTCH1蛋白表達（E）Figure 3 miR-582-5p inhibits activity of HBV promoter and enhancer and inhibits expression of NOTCH1 by targeting

2.3 HBV復制和表達對miR-582-5p的影響 在支持HBV復制HepG2.2.15和HepAd38細胞中，miR-582-5p表達較不含HBV的HepG2細胞表達低（圖1A）。我們進一步分析HBV對miR-582-5p表達的影響。

將pHBV1.2載體轉(zhuǎn)染Huh7細胞，qRT-PCR檢測miR-582-5p的表達情況，結(jié)果如圖4A所示，HBV的復制和表達抑制miR-582-5p的表達。分別將HBV蛋白表達載體轉(zhuǎn)染Huh7細胞，qRT-PCR檢測HBV不同蛋白對miR-582-5p的表達情況，結(jié)果如圖4B所示，HBx抑制miR-582-5p的表達。通過將HBx腺病毒蛋白Ad-HBx感染Huh7細胞，如圖4C所示，進一步證明HBx抑制miR-582-5p的表達。以上結(jié)果表明，在HBV感染中，HBV的復制與表達，特別是HBx蛋白，能夠抑制miR-582-5p的表達。

圖4 HBV抑制miR-582-5p表達A.將pHBV1.2和空載體（Ctr）分別轉(zhuǎn)染Huh7細胞，qRT-PCR檢測miR-582-5p表達；B.將不同HBV蛋白表達載體轉(zhuǎn)染Huh7細胞，qRT-PCR檢測miR-582-5p表達；C.將HBx腺病毒表達載體感染Huh7細胞，qRT-PCR檢測miR-582-5p表達Figure 4 HBV inhibits miR-582-5p expression

3 討 論

miRNAs在宿主與HBV的相互作用扮演著重要的角色，可以直接與HBV轉(zhuǎn)錄本相互作用，也可以間接調(diào)節(jié)HBV 轉(zhuǎn)錄因子，從而影響HBV復制和表達；HBV的復制和表達也可以影響宿主miRNAs表達。

miRNAs可以直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄本，抑制病毒復制。研究表明，miR-122直接靶向HBV聚合酶的編碼區(qū)和HBV核心蛋白的3′UTR從而抑制病毒復制[9]，而miR-125a-5p、miR-199a-3p和miR-210則直接靶向HBsAg編碼區(qū)發(fā)揮抑制作用[10-11]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)miR-582-5p可以抑制HBV DNA、HBV RNA、HBeAg和HBsAg的分泌。然而，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-582-5p與HBV基因組之間沒有直接的相互作用位點。因此，我們推測miR-582-5p可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子而間接影響HBV復制和表達。

miRNAs可通過靶向與病毒復制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子來間接調(diào)節(jié)HBV的復制和表達。研究表明，miR-122對HBV感染發(fā)揮雙重作用，miR-122通過靶向抑制血紅素加氧酶-1促進病毒復制[12]，而通過靶向N-myc下游調(diào)控基因3來抑制病毒復制[13]。miR-29c通過靶向炎癥和免疫的主要調(diào)節(jié)因子腫瘤壞死因子α誘導蛋白3發(fā)揮抑制HBV復制的作用[14]。miR-125b靶向抑制敏感鈉離子通道蛋白1α來抑制HBV DNA中間體形成以及HBsAg和HBeAg的分泌[15]。miR-141和miR-155分別通過直接靶向過氧化物酶體增殖物激活受體α[16]和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β[17]而間接抑制HBV復制。miR-130a通過靶向HBV轉(zhuǎn)錄增強劑過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α和過氧化物酶體增殖物激活受體γ來抑制HBV復制[18]。研究發(fā)現(xiàn)miR-582-5p可以通過抑制HBV S2 promoter和HBV EnhancerⅠ的活性而抑制HBV的復制與表達。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)miR-582-5p可以直接靶向Notch信號通路關(guān)鍵分子NOTCH1。Notch信號通路是一個進化上高度保守的信號轉(zhuǎn)導通路，在肝臟的發(fā)育、再生、肝癌和HBV感染中發(fā)揮非常重要的作用[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制NOTCH1后，HBV DNA、HBV cccDNA和 HBV RNA等HBV復制和表達相關(guān)指標受到明顯抑制，表明NOTCH1能夠促進HBV復制和表達[21]。本研究表明NOTCH1是miR-582-5p靶基因，因此，miR-582-5p可以通過抑制NOTCH1的表達，從而抑制HBV復制與表達。值得關(guān)注的是，NOTCH1還是miR-146a、miR-139-5p等miRNAs的靶基因[22-24]，提示miRNA與NOTCH1的相互作用在不同疾病和生理狀態(tài)下的重要作用。

HBV感染能導致宿主miRNAs表達水平發(fā)生變化。研究表明，miRNAs可以在損傷后從細胞中泄漏，或者可以從細胞分泌到循環(huán)中，這些循環(huán)中的miRNAs可以穩(wěn)定地存在于血清/血漿中，可作為非侵入性生物標志物[25]。研究表明，HBx蛋白可以通過直接與miR-15a/miR-16-1結(jié)合的方式降低其表達[26]。HBx蛋白通過誘導miR-205啟動子高甲基化來抑制腫瘤抑制基因miR-205表達[27]。據(jù)報道，miR-122、miR-22和miR-99a在HBV感染者血清中上調(diào)1.5倍，可作為疾病特異性生物標志物[28]。本研究發(fā)現(xiàn)HBx蛋白抑制miR-582-5p表達，但是HBx降低體內(nèi)miR-582-5p表達的分子機制及其臨床意義需要更多的研究來進一步闡明。

本研究證明，在肝細胞中，miR-582-5p既可抑制HBV S2 promoter和HBV EnhancerⅠ的活性，又可以靶向抑制HBV促進因子NOTCH1，最終抑制HBV復制和表達；反過來，HBV的復制與表達又能抑制miR-582-5p的表達，表明HBV-miR-582-5p與NOTCH1之間存在復雜的相互作用。由此推測在HBV感染中，HBV可以通過抑制miR-582-5p的表達，解除對HBV促進因子NOTCH1的抑制，從而有助于HBV的復制與表達。病毒誘導miRNAs異常表達和miRNAs可以調(diào)節(jié)HBV復制和表達，提示miRNAs可能成為治療HBV感染和HBV相關(guān)性肝癌的潛在靶點。深入研究miRNAs在HBV感染中的作用和機制對于探索治療HBV相關(guān)疾病的新策略具有重要意義。

本研究有不足之處。最新的研究表明，miR-582-5p通過降低NOTCH1在非小細胞肺癌中的表達來抑制細胞增殖和侵襲，miR-582-5p是否在HBV相關(guān)的肝細胞癌中發(fā)揮作用還有待于進一步深入研究[29]。