姜 芬，丁 坤，李紹先，徐 軍，徐艷麗

2019新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）疫情在全球200多個國家和地區(qū)持續(xù)暴發(fā)[1-2]，病原體為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2），屬β冠狀病毒[3]。是繼中東呼吸綜合征冠狀病毒和嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒之后的第三種引起人類嚴重呼吸道疾病的人畜共患病冠狀病毒，也是近20年來第一種引發(fā)全球大流行的冠狀病毒。

對潛伏期患者、無癥狀感染者SARS-CoV-2脫落和播散的研究[4-5]以及從糞便中持續(xù)檢出SARSCoV-2的報道引發(fā)了相關研究者對該感染性疾病管理控制的廣泛關注[6-7]。某些COVID-19患者病毒核酸檢測出現(xiàn)復陽現(xiàn)象，盡管大多推測與檢測靈敏度有關[8]，但亦可能與病毒載量低或病毒脫落規(guī)律不同有關。據(jù)統(tǒng)計，在出院患者中病毒核酸檢測在短暫連續(xù)2次或以上陰性后復陽的患者數(shù)占出院患者總數(shù)的21.4%[9]；此外，超過20.0%的患者在呼吸道標本病毒核酸轉陰后，其糞便標本的病毒核酸檢測仍呈陽性[10]，部分出院患者胃腸道標本中病毒核酸檢測持續(xù)陽性[11]。推測SARSCoV-2可能通過糞-口途徑傳播，增加了二次傳播的風險，也解釋了醫(yī)院感染的原因，如何根據(jù)各類患者特征進行針對性管理和預防控制尤為重要。本研究對COVID-19出院患者鼻咽拭子和糞便標本病毒脫落時間進行隨訪，以評價復陽患者的臨床特征和病毒轉陰時間，以期為COVID-19患者管理控制提供針對性指導意見。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2019年1月15日—2020年2月10日煙臺市奇山醫(yī)院收治的43例COVID-19確診患者為研究對象。根據(jù)住院期間是否出現(xiàn)鼻咽拭子或痰液標本病毒核酸檢測復陽，將患者分為復陽組（n=15）與未復陽組（n=28）。出院后隔離期間每4～7 d復查鼻咽拭子和糞便標本病毒核酸，因患者咳痰癥狀均已消失，遂出院隨訪未采集痰液標本。本研究符合1975年赫爾斯基宣言并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查同意。

1.2 方法 收集所有研究對象的一般資料及臨床特征、實驗室檢查結果、治療措施（包括抗病毒、免疫調節(jié)劑、呼吸支持、抗生素治療等）、流行病學史資料以及病毒核酸檢測結果。所有患者均按照國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[12]進行診斷和治療；采用實時熒光反轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR）進行SARS-CoV-2核酸檢測。

1.3 相關定義及標準 患者出院標準：①體溫恢復正常3 d以上（不使用皮質類固醇或退熱劑）；②呼吸道癥狀明顯好轉；③肺部影像學顯示炎癥明顯吸收；④連續(xù)2次呼吸道標本SARS-CoV-2核酸檢測陰性（采樣時間間隔≥24 h）。初始病毒核酸轉陰時間：SARS-CoV-2核酸檢測至少2次連續(xù)陰性結果中首次陰性的時間。病毒核酸復陽患者：在至少連續(xù)3次病毒核酸檢測陰性后（采樣時間間隔＞24 h），再次出現(xiàn)病毒核酸陽性者。病毒最長脫落時間：從發(fā)病之日起至連續(xù)2次病毒核酸檢測陰性之日為止，且在至少2周的隨訪期間未出現(xiàn)核酸檢測陽性結果。其中，對于病毒核酸復陽患者，病毒最長脫落時間為從發(fā)病之日起至隨訪期間最后一次SARS-CoV-2核酸檢測呈陽性之日。間斷陰性狀態(tài)：連續(xù)2次或以上病毒核酸RT-PCR檢測為陰性后病毒核酸復陽之前的狀態(tài)，時間計算為從第1 d核酸檢測為陰性到連續(xù)陰性檢測結束。實驗室檢測指標正常參考值：白細胞計數(shù)（3.5～9.5）×109/L、中性粒細胞計數(shù)（1.8～6.3）×109/L、淋巴細胞計數(shù)（1.1～3.2）×109/L、血小板計數(shù)（125～ 350）×109/L、CRP 0～5 mg/L、血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A,SAA）＜10 mg/L。

1.4 標本采集 采集患者鼻咽拭子、痰和糞便標本，并將樣本存放于2～8 ℃的病毒轉運介質中。痰液標本，鼓勵患者嚴重咳嗽，將痰液收集到一次性無菌旋轉蓋取樣杯中，加入2 ml蛋白酶K（1 g/L），30 min內進行病毒核酸檢測；血清樣本收集于血清分離管中進行離心操作。

1.5 SARS-CoV-2核酸檢測 使用QIAamp病毒核酸迷你試劑盒試劑（德國凱杰）提取和純化核酸。使用SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒（中山大學達安基因，中國廣州）進行RT-PCR檢測，針對SARS-CoV-2基因組的Orf1ab區(qū)域和N基因，使用QuantStudio 5 RT-PCR系統(tǒng)（美國應用生物系統(tǒng)公司）。陽性定義為2次獨立重復試驗至少1次成功擴增，周期閾值為40。中間陰性RT-PCR結果持續(xù)＜3 d或＜2次連續(xù)試驗視為無效或假陰性結果[9]。患者入院后，每隔1 d采集鼻咽拭子標本和痰標本進行病毒核酸檢測，直至患者符合出院標準。出院后每4～7 d收集患者鼻咽拭子標本和糞便標本，進行病毒核酸檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SAS 9.4軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，組間差異比較采用t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。統(tǒng)計學檢驗均為雙側檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般特征 43例患者中男性22例（51.2%），女性21例（48.8%），中位年齡47.0（37.0，54.0）歲，入院時發(fā)病中位時間為3.0（2.0，6.0）d，住院中位時間為25.0（19.0，29.0） d，10例（23.3%）患者具有基礎疾病史（高血壓、糖尿病、支氣管哮喘、潰瘍性結腸炎、冠心病及貧血），5例（11.6%）患者為重癥患者。所有患者均接受抗病毒藥物（利托那韋/洛匹那韋）治療；21例（48.8%）患者接受經(jīng)驗性抗生素治療；41例（95.3%）患者從入院開始接受吸入IFN治療（8000 U，2噴/次，3次/d）；12例（27.9%）患者CD4淋巴細胞計數(shù)異常下降，接受胸腺肽皮下注射治療（1.6 mg，2次/周）；8例（18.6%）患者接受氧療；經(jīng)治療后所有患者均完全康復。復陽組和未復陽組在年齡、性別、入院時發(fā)病時間、基礎疾病史等方面差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），復陽組患者住院時間更長（Z=0.425，P=0.016）。未復陽組患者接受抗生素治療比例高于復陽組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 43例COVID-19患者的一般資料Table 1 General information of 43 COVID-19 patients

2.2 臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果 43例患者最常見的癥狀為咳嗽（88.4%）、咳痰（79.1%）和發(fā)熱（76.7%），上述癥狀的中位持續(xù)時間分別為18.0（8.0，26.0） d、10.5（5.0，20.0） d和7.0（3.5，10.5） d；大約1/3的患者伴有胸痛、焦慮/失眠等癥狀。入院時實驗室檢查結果顯示25.6%患者白細胞計數(shù)減少，20.9%患者淋巴細胞計數(shù)下降，34.9%患者CRP水平升高，20.9%患者SAA水平升高。與未復陽組相比，復陽組患者均為普通型，最高體溫更低，咳痰持續(xù)時間更短，ESR、CRP、SAA水平更低（P均＜0.05）。詳見表2。

表2 43例COVID-19患者的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果[例(%)]Table 2 Clinical manifestations and laboratory test results of 43 COVID-19 patients[cases(%)]

2.3 實驗室檢查

2.3.1 呼吸道標本中SARS-CoV-2脫落時間 43例患者鼻咽拭子和痰液標本中SARS-CoV-2核酸轉陰的中位時間分別為15.5（13.0，23.0）d和24.0（14.0，31.0）d，鼻咽拭子短于痰液樣本。雖然2組患者鼻咽拭子標本病毒核酸初始轉陰時間差異無統(tǒng)計學意義，但復陽組鼻咽拭子標本病毒最長脫落時間顯著延長，痰液標本中病毒脫落時間較未復陽組也顯著延長，差異均具有統(tǒng)計學意義，詳見表3。住院期間復陽組患者中以鼻咽拭子標本復陽比例較高為93.3%（14/15），痰液標本病毒核酸較少出現(xiàn)復陽現(xiàn)象，僅1例。

表3 43例 COVID-19患者的病毒核酸檢測/持續(xù)時間（d）Table 3 Viral nucleic acid test/duration of 43 COVID-19 patients(d)

2.3.2 糞便標本核酸檢測結果及出院后隨訪 本研究中共采集了10例患者住院期間的糞便標本并進行SARS-CoV-2核酸檢測，其中4例顯示陽性，均為復陽組患者。更值得注意的是，這4例患者中，有3例在鼻咽拭子標本核酸檢測結果轉陰后糞便標本中仍能檢測到病毒核酸。為進一步研究復陽患者病毒脫落模式，對康復患者鼻咽拭子和糞便樣本病毒核酸進行追蹤檢測，發(fā)現(xiàn)共有7例患者治愈出院后經(jīng)隨訪檢測到病毒核酸陽性（5例糞便標本病毒核酸陽性，3例鼻咽拭子病毒核酸陽性），其中1例鼻咽拭子和糞便標本同時復陽。上述出院后隨訪病毒檢測陽性者均為住院期間鼻咽拭子病毒復陽組患者，且患者糞便標本病毒核酸陽性持續(xù)時間最長可達出院后19 d。

2.4 胸部CT 典型COVID-19患者胸部CT表現(xiàn)呈雙肺多發(fā)斑片狀磨玻璃影。本研究中所有患者出院時胸部CT表現(xiàn)均有改善，而呼吸道標本SARS-CoV-2核酸復陽和糞便標本中病毒核酸持續(xù)陽性患者均未發(fā)現(xiàn)胸部CT較前改變。

3 討 論

目前，SARS-CoV-2核酸檢測復陽現(xiàn)象被認為是RT-PCR檢測假陰性的結果[11]，但尚未排除其他可能性。牛衛(wèi)東等[13]的研究表明痰液標本的SARS-CoV-2核酸陽性檢出率遠遠高于咽拭子標本和鼻拭子標本。病毒脫落通常被視作傳染性的標志[14]，研究表明，非危重患者呼吸道標本中SARS-CoV-2脫落中位時間約為18～20 d，下呼吸道比上呼吸道標本病毒脫落時間更長[15-19]。另有報道稱約21.4%的患者在連續(xù)2次SARS-CoV-2核酸檢測結果轉陰后出現(xiàn)復陽，連續(xù)3次鼻咽拭子陰性的患者肺中仍然有SARS-CoV-2殘留[9]。本研究中34.9%的患者在短暫的病毒核酸檢測轉陰后又復陽，且與未復陽組患者相比，該類患者多表現(xiàn)為輕度感染、輕度發(fā)熱、咳痰時間短，痰液標本中病毒脫落時間較上呼吸道標本更長，糞便標本病毒核酸陽性率更高，與上述研究結果吻合。有研究結果顯示，在患者腸道原位檢測到病毒復制信號[20]或腸道高表達SARS-CoV-2感染所需受體[21]。根據(jù)本研究中病毒核酸復陽患者不同部位采集標本病毒清除時間、病毒持續(xù)脫落趨勢特征，推測胃腸道存在病毒受體的可能。有學者將患者病毒核酸檢測復陽現(xiàn)象歸因于取樣、RT-PCR檢測假陰性和核酸轉陰時間延長等因素，然而，病毒感染在某些靶細胞潛伏或與相應受體反應的可能性并沒有被排除，這須要進一步研究病毒載量、分離測序病毒株等。

有研究報道，較高病毒載量、上呼吸道較長的病毒脫落時間與疾病嚴重程度有關[14，16，22]。本研究尚未發(fā)現(xiàn)病毒脫落時間延長與疾病嚴重程度相關的證據(jù)，恰恰相反，本研究中復陽組患者更多表現(xiàn)為輕癥，且5例重癥患者均未發(fā)生病毒核酸檢測結果復陽的現(xiàn)象?？紤]結論不一致的原因可能為多方面，首先，本研究中的復陽組并不能代表全部病毒清除延遲患者群體；其次，考慮慢性病毒脫落或病毒變異株產(chǎn)生[23-24]、機體適應性免疫應答變化等因素導致患者病毒核酸檢測復陽或病毒清除延遲，而與疾病嚴重程度無關。

最近從COVID-19患者糞便樣本中分離得到SARS-CoV-2的研究證實，該病毒可能通過胃腸道傳播[25-28]，其他研究也發(fā)現(xiàn)57.1%的病毒核酸檢測復陽患者在其糞便樣本中檢測出SARS-CoV-2核酸，且持續(xù)時間比呼吸道樣本更長，病毒載量峰值出現(xiàn)更晚[29-31]。本研究中也存在部分復陽患者在其呼吸道樣本中幾乎檢測不到病毒核酸的情況下，糞便標本依然呈現(xiàn)持續(xù)病毒核酸陽性，且無臨床癥狀，與上述研究結果吻合，提示糞便標本病毒檢測是判斷患者出院和解除隔離的另一種可行性指標，特別是針對核酸檢測復陽患者。另外，本研究中未發(fā)現(xiàn)糞便標本中病毒核酸檢出率和持續(xù)時間與疾病嚴重程度、疾病進展的關系，與既往研究一致[32]，考慮可能與宿主免疫應答或胃腸道黏膜免疫有關[33]。

綜上所述，SARS-CoV-2核酸復陽患者更可能表現(xiàn)為輕癥感染，同時該類患者存在痰液標本病毒脫落延遲和糞便標本病毒核酸持續(xù)陽性的特點，因而對病毒核酸復陽患者應給予特別關注和更長時間的醫(yī)學觀察，以預防和控制疫情的再次傳播。

當然，本研究也存在一定局限性，首先，本研究樣本量較小，對COVID-19患者的治療方案是經(jīng)驗性的，實施的藥物干預特別是抗病毒藥物和免疫調節(jié)劑對病毒排出的影響尚未確定被排除；其次，本研究未進行病毒載量和活病毒顆粒分離，不能從病毒核酸痕跡中得出具體的傳染性結論；再次，未進行SARS-CoV-2的IgG或IgM抗體檢測來描述不同標本陽性檢測的精確時間窗。COVID-19作為一種新發(fā)傳染病，我們對于SARSCoV-2在臨床特征等方面的認識尚有不足，仍須進一步持續(xù)跟蹤探究，用以指導臨床、預后判斷和和傳播控制。