萬(wàn)子玉，李巧，賴月月，劉佳靈，敬勇，李敏

成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137

半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)作為流通廣泛的大宗藥材，近年來(lái)需求量不斷增加，但野生的半夏資源不斷衰減，使得栽培半夏所占的比重越來(lái)越大。連作障礙(continuous cropping obstacles; replant problems; replant disease)，即在同一塊土壤中連續(xù)栽培同種或同科作物時(shí)，即使在正常的栽培管理狀況下，也會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降和病蟲(chóng)害嚴(yán)重的現(xiàn)象，連作障礙在早期研究中被稱為“土壤病”。連作障礙是藥用植物栽培中的一種常見(jiàn)現(xiàn)象，尤以根或根莖入藥的藥材生產(chǎn)中表現(xiàn)最為突出，如半夏、人參、地黃、三七和丹參等[1-4]都存在著嚴(yán)重的連作障礙問(wèn)題，表現(xiàn)為輕則減產(chǎn)，重則絕收。引起作物連作障礙的主要因素可以歸納為化感自毒作用、土壤微生態(tài)發(fā)生改變，土傳病蟲(chóng)害嚴(yán)重、土壤理化性質(zhì)改變等[5-8]，其中化感自毒作用是目前連作障礙研究熱點(diǎn)之一。李培棟等[9]分析花生(ArachishypogaeaLinn.)連作土壤中酚酸類(lèi)化感物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)土壤中對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、香豆素和苯甲酸會(huì)抑制花生幼苗生長(zhǎng)并提高花生的發(fā)病率。杜家方等[10]在研究連作地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)根際土壤中酚酸類(lèi)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)阿魏酸、香豆酸、丁香酸和對(duì)羥基苯甲酸酚酸類(lèi)物質(zhì)會(huì)抑制地黃塊根生長(zhǎng)，引發(fā)連作效應(yīng)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)半夏連作土壤中含有對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、對(duì)香豆酸和阿魏酸，這6種酚酸均是文獻(xiàn)中經(jīng)常報(bào)道的酚酸類(lèi)化感物質(zhì)，且對(duì)半夏的生長(zhǎng)發(fā)育具有較強(qiáng)的化感作用[10-11]，故推測(cè)半夏的連作障礙現(xiàn)象也與以上酚酸類(lèi)物質(zhì)所引起的化感自毒作用有關(guān)。目前，對(duì)半夏酚酸類(lèi)化感物質(zhì)的積累和分泌少有研究，半夏的酚酸類(lèi)化感物質(zhì)在不同時(shí)期的分泌和積累的研究更是缺乏。實(shí)驗(yàn)針對(duì)連作土壤中已分離鑒定的6種酚酸類(lèi)化感物質(zhì)，對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的半夏植株、根際土壤中的酚酸類(lèi)成分進(jìn)行分析研究，探究半夏植株中6種酚酸類(lèi)成分的積累規(guī)律，為緩解半夏化感自毒作用和消減連作障礙、為提高其產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

半夏種莖來(lái)源于四川省南充市龍門(mén)鎮(zhèn)的野生種莖，直徑1.5～2.0 cm。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)的李敏教授鑒定，為天南星科植物半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)的塊莖。

方形花盆、河沙、珍珠巖、蛭石和配方全營(yíng)養(yǎng)液購(gòu)于廣東天禾農(nóng)資股份有限公司。

1.2 試劑與儀器1.2.1 試劑

98%對(duì)羥基苯甲酸(批號(hào)：wkq17060502)、99%丁香酸(批號(hào)：wkq17112307)、98%香草酸(批號(hào)：wkq17112206)、98%香草醛(批號(hào)：wkq17052406)、99%對(duì)香豆酸(批號(hào)：wkq17081114)和98%阿魏酸(批號(hào)：wkq17112004)均購(gòu)自成都維克奇生物科技有限公司，上述各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。水為蒸餾水，乙腈和磷酸為色譜純，濃鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯和甲醇等均為分析純，均購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2.2 儀器

WATERS E2695高效液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司)，Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱(島津公司)；Allegra 64R Centrifuge型冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter)；DUG-9070B智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SQP萬(wàn)分之一天平(賽多利科學(xué)儀器(北京)有限公司)；PHS-3E型pH劑(雷磁-上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；HY-BⅡ回旋振蕩器(江蘇金怡儀器科技有限公司)。

1.3 方法1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

取半夏種莖，用蒸餾水反復(fù)沖洗，除去泥沙雜質(zhì)。浸泡5 h，消毒，取出瀝干備用。將半夏整齊放置于鋪有潔凈石英砂的育苗盤(pán)中，置于溫度為20～23 ℃的生化培養(yǎng)箱中催苗。待半夏發(fā)芽后，取生長(zhǎng)情況一致的半夏移栽至含河沙、珍珠巖和蛭石的混合配方基質(zhì)中，置于20～25 ℃玻璃人工氣候室中培養(yǎng)，期間每隔4 d澆一次0.075%的全營(yíng)養(yǎng)液(以保證半夏植株正常生長(zhǎng))。半夏出苗后15 d開(kāi)始取樣，之后每隔半個(gè)月對(duì)半夏植株進(jìn)行取樣，每個(gè)育苗盤(pán)每次取5株，共取6次。將半夏植株分為須根、塊莖(去皮)、塊莖皮和葉4個(gè)部分，50 ℃烘干備用；收集半夏根際土壤(半夏植株取出后小心抖掉粗沙，用軟毛刷刷下附著在須根上面的少量沙子，除去殘根等雜質(zhì))自然風(fēng)干備用。

取半夏種莖，用清水反復(fù)沖洗，除去泥沙雜質(zhì)。浸泡5 h，取出瀝干備用。稱取300 g經(jīng)消毒的潔凈石英砂置于發(fā)芽盒中，移取0、0.0016、0.0162、0.0812、0.1624和0.6496 mg·L-1的對(duì)香豆酸脅迫液各50 mL，加入石英砂中并充分拌勻，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。處理后石英砂中酚酸含量分別為0.00、0.27、2.73、13.67、27.33和109.33 μg·g-1。取36顆已消毒的半夏種莖種整齊植入處理好的發(fā)芽盒中。將布置好的發(fā)芽盒放入(20±1) ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)。

1.3.2 色譜條件

色譜條件參考吳立潔等[12]建立的測(cè)定6種酚酸的方法，并進(jìn)行優(yōu)化。WATERS E2695高效液相色譜儀，Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件如表1所示；流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；柱溫為25 ℃。

1.3.3 半夏酚酸含量測(cè)定

供試品溶液的制備：根際土壤制備方法參考吳立潔等[12]的方法，并進(jìn)行優(yōu)化。稱取土樣(過(guò)4號(hào)篩)100 g，置于500 mL錐形瓶中，加入1 mol·L-1NaOH溶液100 mL，振搖6 h，靜置18 h，離心，取上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5左右，8 000 r·min-1離心5 min，取上清20 mL，加乙酸乙酯40 mL萃取5次。合并乙酸乙酯層，減壓濃縮干燥。準(zhǔn)確吸取2 mL甲醇溶解殘?jiān)?.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

半夏植株各部位半夏酚酸提取參考饒國(guó)棟和張建國(guó)[13]的方法，并進(jìn)行優(yōu)化。稱取樣品粉末(過(guò)4號(hào)篩)2 g，置150 mL錐形瓶中，加1 mol·L-1NaOH 50 mL，振搖6 h，靜置18 h，離心，取上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5，8 000 r·min-1離心5 min，取上清10 mL，用乙酸乙酯萃取5次，每次20 mL，合并萃取液，減壓干燥。準(zhǔn)確吸取2 mL甲醇溶解殘?jiān)?.22 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取對(duì)羥基苯甲酸、香草醛、香草酸、對(duì)香豆酸、丁香酸和阿魏酸對(duì)照品，置于10 mL容量瓶中，以甲醇制成每1 mL含羥基苯甲酸100 μL、香草醛100 μL、香草酸100 μL、對(duì)香豆酸100 μL、丁香酸400 μL和阿魏酸100 μL混合對(duì)照品溶液。

1.3.4 發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定

待半夏種莖開(kāi)始發(fā)芽時(shí)，每天記錄半夏種莖的發(fā)芽數(shù)，共記錄14 d。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用刻度尺測(cè)定各處理半夏植株的根長(zhǎng)。

1.3.5 評(píng)價(jià)方法

發(fā)芽率(%)=(萌發(fā)終期正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=(萌發(fā)高峰期正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%，萌發(fā)高峰期指發(fā)芽過(guò)程中日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰的時(shí)期；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt，式中：Gt為在td時(shí)的種子發(fā)芽數(shù)，Dt為相對(duì)應(yīng)的發(fā)芽時(shí)間(d)；

化感效應(yīng)指數(shù)(response index, RI)采用Bruce Wiliamson和Richardson[14]的方法：RRI=1-C/T(當(dāng)T≥C時(shí))或RRI=C/T-1(當(dāng)T0時(shí)，表示促進(jìn)作用，當(dāng)RRI<0時(shí)，表示抑制作用，

表1 高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of high performance liquid chromatography (HPLC)

RRI絕對(duì)值代表化感作用強(qiáng)度。

1.3.6 分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理采用Excel2016，分析作圖采用GraphPad6，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS21.0。

2 結(jié)果(Results)

吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，對(duì)半夏根際土及半夏各部位所含酚酸進(jìn)行定性和定量分析。從半夏植株的須根、塊莖(去皮)、塊莖皮和葉中均鑒定出6種相同的酚酸類(lèi)成分，分別為對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、對(duì)香豆酸和阿魏酸(圖1)；根際土的鑒定結(jié)果與半夏植株的相同(圖2)。

2.1 不同生長(zhǎng)時(shí)間的半夏須根中酚酸含量的積累變化

不同生長(zhǎng)時(shí)間的半夏須根中酚酸含量測(cè)定結(jié)果如表2所示，半夏須根中總酚酸含量范圍為238.59～

578.65 μg·g-1，不同生長(zhǎng)時(shí)間總酚酸含量存在顯著性差異(P<0.05)，隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚酸含量呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)，當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)間為90 d時(shí)達(dá)到最高，約為生長(zhǎng)15 d含量的2.4倍。同一時(shí)期各酚酸的含量均有所差異，具體表現(xiàn)為對(duì)香豆酸>香草醛>對(duì)羥基苯甲酸>香草酸>阿魏酸>丁香酸，含量最高的對(duì)香豆酸約為含量最低的丁香酸63倍。隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，須根中的6種酚酸的含量皆呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)，且存在顯著性差異(P<0.05)，除丁香酸在60 d時(shí)含量達(dá)到最高外，其余5種酚酸均在90 d時(shí)含量達(dá)到最高。

圖1 對(duì)照品及供試品HPLC色譜圖注：A.對(duì)照品，B.須根，C.塊莖(去皮)，D.塊莖皮，E.葉；1.對(duì)羥基苯甲酸，2.香草酸，3.丁香酸，4.香草醛，5.對(duì)香豆酸，6.阿魏酸。Fig. 1 HPLC chromatogram of reference substance and sampleNote: A. Control, B. Fibrous root, C. Tuber (peeled), D. Tuber skin, E. Leaf; 1. p-hydroxybenzoic acid, 2. Vanillic acid, 3. Syringic acid, 4. Vanillin, 5. p-coumaric acid, 6. Ferulic acid.

圖2 對(duì)照品(A)及根際土樣品(B)HPLC色譜圖注：1.對(duì)羥基苯甲酸；2.香草酸；3.丁香酸；4.香草醛；5.對(duì)香豆酸；6.阿魏酸。Fig. 2 HPLC chromatogram of reference substance (A) and rhizosphere soil sample (B)Note: 1. p-hydroxybenzoic acid; 2. Vanillic acid; 3. Syringic acid; 4. Vanillin; 5. p-coumaric acid; 6. Ferulic acid.

2.2 不同生長(zhǎng)時(shí)間的半夏塊莖(去皮)中酚酸含量的積累變化

不同生長(zhǎng)時(shí)間的半夏塊莖(去皮)中酚酸含量測(cè)定結(jié)果如表3所示，半夏塊莖(去皮)中總酚酸含量范圍為9.86～16.58 μg·g-1，不同生長(zhǎng)時(shí)間總酚酸含量之間存在顯著性差異(P<0.05)，隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚酸呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)間為60 d時(shí)達(dá)到最高，約為生長(zhǎng)15 d含量的1.7倍。在同一時(shí)期半夏塊莖中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為香草醛>香草酸>對(duì)羥基苯甲酸>丁香酸>阿魏酸>對(duì)香豆酸，香草醛含量約為對(duì)香豆酸的11倍。隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，塊莖(去皮)中除丁香酸呈逐漸升高的趨勢(shì)外，其余5種酚酸的含量皆呈先升后降的趨勢(shì)，且存在顯著性差異(P<0.05)，對(duì)羥基苯甲酸和香草醛在45 d時(shí)含量達(dá)到最高，香草酸和阿魏酸在45 d時(shí)含量達(dá)到最高，對(duì)香豆酸和丁香酸分別在75 d和90 d時(shí)含量達(dá)到最高。

2.3 不同生長(zhǎng)時(shí)間的半夏塊莖皮中酚酸含量的積累變化

不同生長(zhǎng)時(shí)間的半夏塊莖皮中酚酸含量測(cè)定結(jié)果如表4所示，半夏塊莖皮中總酚酸含量范圍為324.58～399.91 μg·g-1，不同生長(zhǎng)時(shí)間總酚酸含量存在顯著性差異(P<0.05)，隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚酸含量呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)，當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)間為90 d時(shí)含量達(dá)到最高，約為生長(zhǎng)60 d時(shí)含量的1.2倍。半夏塊莖皮中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為香草醛>香草酸>對(duì)羥基苯甲酸>阿魏酸>對(duì)香豆酸>丁香酸，香草醛含量約為丁香酸的31倍。隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，塊莖皮中除對(duì)羥基苯甲酸外，其余5種酚酸皆呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)，且存在顯著性差異(P<0.05)。

表2 不同生長(zhǎng)時(shí)間半夏須根中酚酸含量變化Table 2 Changes of phenolic acids contents in fibrous roots of Pinellia ternata (Thunb.) Breit. at different growth times n=3) (μg·g-1)

表3 不同生長(zhǎng)時(shí)間半夏塊莖(去皮)中酚酸含量變化Table 3 Changes of phenolic acids contents in Pinellia ternata (Thunb.) Breit. tubers (peeled) at different growth times n=3) (μg·g-1)

2.4 不同生長(zhǎng)時(shí)間的半夏葉中酚酸含量的積累變化

不同生長(zhǎng)時(shí)間的半夏葉中酚酸含量測(cè)定結(jié)果如表5所示?？偡铀岷糠秶鸀?8.94～70.04 μg·g-1，不同生長(zhǎng)時(shí)間總酚酸之間存在顯著性差異(P<0.05)，隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚酸呈逐漸上升的趨勢(shì)，當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)間為90 d時(shí)達(dá)到最高，約為生長(zhǎng)15 d含量的3.7倍。葉中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為香草醛>香草酸>對(duì)羥基苯甲酸>對(duì)香豆酸>丁香酸、阿魏酸，香草醛含量約為丁香酸的6倍。隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，葉中除阿魏酸含量呈先升高后降低的趨勢(shì)外，其余5種酚酸含量皆呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)，且存在顯著性差異(P<0.05)，除香草酸、阿魏酸分別在60 d和75 d時(shí)含量達(dá)到最高外，其余酚酸均在90 d時(shí)含量達(dá)到最高。

2.5 不同生長(zhǎng)時(shí)間的半夏根際土中酚酸含量的積累變化

不同生長(zhǎng)時(shí)間的半夏根際土中酚酸含量測(cè)定結(jié)果如表6所示，半夏根際土中總酚酸含量范圍為0.5773～1.2694 μg·g-1，不同生長(zhǎng)時(shí)期總酚酸含量存在顯著性差異(P<0.05)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)總酚酸含量呈先升后緩慢下降的趨勢(shì)，當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)間為75 d時(shí)達(dá)到最高，約為生長(zhǎng)15 d含量的2.2倍。根際土中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為對(duì)香豆酸>對(duì)羥基苯甲酸>香草醛>香草酸>丁香酸>阿魏酸，對(duì)香豆酸含量約為阿魏酸含量的22倍。隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，根際土中除對(duì)香豆酸含量呈逐漸升高的趨勢(shì)外，其余酚酸的含量皆呈先升后降的趨勢(shì)，且存在顯著性差異(P<0.05)，除丁香酸和對(duì)香豆酸分別在60 d和90 d時(shí)含量達(dá)到最高外，其余酚酸均在75 d時(shí)含量達(dá)到最高。

2.6 半夏植株不同部位酚酸最終積累量

半夏植株不同部位酚酸最終積累量測(cè)定結(jié)果如表7所示，半夏植株不同部位酚酸除丁香酸和對(duì)香豆酸外，其余酚酸的最終積累量均存在顯著性差異(P<0.05)，總酚酸積累量以半夏須根最高，塊莖(去皮)最低，大小規(guī)律為：須根>莖皮>葉>塊莖(去皮)(P<0.01)，須根約為塊莖(去皮)的42倍。半夏植株中6種酚酸的積累規(guī)律為：對(duì)香豆酸>香草醛>香草酸>對(duì)羥基苯甲酸>阿魏酸>丁香酸，其中對(duì)香豆酸積累量以須根最高，達(dá)410.92 μg·g-1，塊莖(去皮)最低，須根積累量約為塊莖(去皮)積累量的708倍。對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛和阿魏酸則均以塊莖皮積累量最高，塊莖(去皮)最低。

表4 不同生長(zhǎng)時(shí)間半夏塊莖皮中酚酸含量變化Table 4 Changes of phenolic acids contents in tuber skin of Pinellia ternata (Thunb.) Breit. at different growth times n=3) (μg·g-1)

表5 不同生長(zhǎng)時(shí)間半夏葉中酚酸含量變化Table 5 Changes of phenolic acids contents in leaf of Pinellia ternata (Thunb.) Breit. at different growth times n=3) (μg·g-1)

2.7 對(duì)香豆酸對(duì)半夏種莖萌發(fā)的影響

由表8可知，半夏種莖在對(duì)香豆酸脅迫下，除根長(zhǎng)隨脅迫濃度的升高呈下降的趨勢(shì)外，其余3個(gè)指標(biāo)皆隨脅迫濃度的升高呈先升后降的趨勢(shì)。其中，當(dāng)脅迫濃度達(dá)到0.6496 mg·L-1，即石英砂中濃度為109.33 μg·g-1時(shí)，半夏的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)和根長(zhǎng)皆顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，分別較對(duì)照組(0.00 mg·L-1)降低了13.93%、17.31%、45.00%和24.43%，化感指數(shù)分別為-0.14、-0.17、-0.21和-0.24。

3 討論(Discussion)

半夏植株各部位總酚酸最終積累量的規(guī)律為須根>塊莖皮>葉>塊莖(去皮)；隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，半夏植株不同部位中6種酚酸不斷積累，均在60～90 d時(shí)達(dá)到最高，其中對(duì)香豆酸含量最高，且大部分存在于須根中，此時(shí)半夏根際土中對(duì)香豆酸和總酚酸含量達(dá)到最高。實(shí)驗(yàn)所用根際土為石英砂，故最終半夏根際土中對(duì)香豆酸和總酚酸均來(lái)自半夏植株，推測(cè)半夏分泌的酚酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)香豆酸占主要地位。半夏塊莖(去皮)的對(duì)香豆酸和總酚酸均是先增加后降低，但最終塊莖(去皮)的對(duì)香豆酸和總酚酸較初始時(shí)有所增加的。第75天半夏塊莖(去皮)中對(duì)香豆酸和總酚酸開(kāi)始降低，而第75天時(shí)半夏須根和塊莖皮中的對(duì)香豆酸和總酚酸開(kāi)始急劇增加，推測(cè)半夏塊莖(去皮)中的對(duì)香豆酸和總酚酸均向半夏的須根和塊莖皮中轉(zhuǎn)移。

表6 不同生長(zhǎng)時(shí)間半夏根際土中酚酸含量變化 Table 6 Changes of phenolic acids contents in rhizosphere soil of Pinellia ternata (Thunb.) Breit. at different growth times n=3) (μg·g-1)

表7 半夏植株不同部位酚酸最終積累量Table 7 Final accumulation of phenolic acids in different parts of Pinellia ternate (Thunb.) (μg·g-1)

表8 對(duì)香豆酸對(duì)半夏種莖萌發(fā)的影響Table 8 Effect of p-coumaric acid on seed stem germination of Pinellia ternate n=3)

當(dāng)對(duì)香豆酸濃度達(dá)到109.33 μg·g-1時(shí)，能顯著降低半夏種莖的發(fā)芽率，而在第90天時(shí)半夏須根中的對(duì)香豆酸含量為410.92 μg·g-1，遠(yuǎn)大于脅迫的濃度。據(jù)此可以推測(cè)半夏植株會(huì)向土壤中釋放酚酸，使得半夏土壤中總酚酸和對(duì)香豆酸達(dá)到脅迫的閾值，從而使得半夏在連作過(guò)程中產(chǎn)生化感自毒作用。何志貴[11]的研究表明，化感自毒物質(zhì)是引起半夏連作障礙的重要因素，其中酚酸是其重要的組成成分。張丹等[15]的研究表明栽培過(guò)程中隨黃連生長(zhǎng)年限的增加，連作地土壤中總酚酸的含量均表現(xiàn)為增加。吳立潔等[12]研究發(fā)現(xiàn)，三七根際土壤中對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸和苯甲酸6種酚酸類(lèi)物質(zhì)是由三七植物須根殘?bào)w腐解產(chǎn)生。徐小軍等[16]的研究表明，隨著阿魏酸質(zhì)量濃度的提高，西瓜根和莖中的超氧陰離子濃度及膜質(zhì)過(guò)氧化程度顯著增加；張恩平等[17]研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸和肉桂酸會(huì)破壞番茄根部保護(hù)酶系統(tǒng)的平衡，造成了根系的膜質(zhì)過(guò)氧化，沈玉聰?shù)萚18]在研究酚酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)三七幼苗的化感影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，外源性添加對(duì)香豆酸會(huì)降低幼苗根系活力和株高。有研究表明，對(duì)香豆酸處理幼苗后，植株體內(nèi)可溶性蛋白含量、過(guò)氧化氫酶活性、過(guò)氧化物酶活性以及超氧化物歧化酶活性均有所降低，從而抑制了小麥的地下根的生長(zhǎng)[19]。對(duì)香豆酸處理大豆后會(huì)顯著降低干物質(zhì)產(chǎn)量、葉片膨脹、高度、葉片產(chǎn)量、凈同化率(單位葉面積干物質(zhì)產(chǎn)量的比率)和葉面積持續(xù)時(shí)間(處理間隔期間存在的總?cè)~面積)[20]。據(jù)此分析，本研究中當(dāng)半夏植株的須根中的對(duì)香豆酸濃度≥109.33 μg·g-1時(shí)，須根的抗氧化酶系統(tǒng)皆開(kāi)始遭到破壞，無(wú)法抵抗對(duì)香豆酸引起的自毒作用，最終抑制了半夏幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，乃至通過(guò)影響半夏根系的生長(zhǎng)發(fā)育和植株葉片的化合作用引起半夏長(zhǎng)期連作的提前倒苗，進(jìn)而導(dǎo)致減產(chǎn)和土壤病的發(fā)作。推測(cè)半夏產(chǎn)地的連作障礙可能是每年半夏采收后殘留的須根殘?bào)w經(jīng)腐解后產(chǎn)生了對(duì)香豆酸、阿魏酸和對(duì)羥基苯甲酸等酚酸類(lèi)物質(zhì)，對(duì)其產(chǎn)生了毒害作用。

Bai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，煙草的連作降低土壤pH，促進(jìn)酚酸積累，從而改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，最終影響煙草生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)香豆酸通過(guò)增加鐮刀菌型等有害菌群，減少有益菌群，改變了黃瓜根際細(xì)菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)和組成，導(dǎo)致黃瓜發(fā)生自毒效應(yīng)[22-23]。據(jù)此分析，在半夏產(chǎn)地長(zhǎng)期連作過(guò)程中，土壤中的對(duì)香豆酸不斷積累，在這個(gè)過(guò)程中對(duì)香豆酸可能會(huì)改變半夏土壤中的微生物平衡，通過(guò)促進(jìn)有害微生物增加，抑制有益型微生物的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致半夏的化感自毒作用。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)香豆酸濃度達(dá)到較高濃度時(shí)能顯著抑制半夏種莖的萌發(fā)，在不同時(shí)間段半夏植株各部位酚酸最終積累量均是以半夏須根中對(duì)香豆酸含量最高，可以推測(cè)半夏植株特別是半夏須根可能是連作土壤中酚酸類(lèi)化感物質(zhì)的潛在來(lái)源，對(duì)香豆酸為重要的酚酸類(lèi)化感物質(zhì)，對(duì)香豆酸可能為半夏植株中重要的次生代謝產(chǎn)物，其對(duì)半夏植株生長(zhǎng)的意義還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，半夏植株不同部位均含相同的6種酚酸類(lèi)成分，分別為對(duì)香豆酸、香草醛、香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸和丁香酸，其總酚酸含量以半夏的須根最高，規(guī)律為須根>塊莖皮>葉>塊莖(去皮)。隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，半夏的塊莖皮、須根、葉和根際土中的對(duì)香豆酸和總酚酸呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)，不斷積累，最終在第90天時(shí)達(dá)到最高；而半夏塊莖(去皮)中的對(duì)香豆酸和總酚酸在75 d時(shí)達(dá)到最高，但此時(shí)半夏塊莖(去皮)的對(duì)香豆酸和總酚酸開(kāi)始向半夏的須根和根際土壤中轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步使半夏須根和根際土在第90天時(shí)積累的對(duì)香豆酸和總酚酸含量達(dá)到更高。而其他5種酚酸均在60～90 d時(shí)達(dá)到最高。第75天時(shí)半夏須根中對(duì)香豆酸含量達(dá)410.92 μg·g-1，是引發(fā)半夏自毒作用而抑制半夏幼苗生長(zhǎng)發(fā)育所需濃度的2倍。