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        天然有機(jī)質(zhì)對(duì)TiO2納米顆粒與PCB-77藻類(lèi)毒性影響及致毒機(jī)理

        2021-03-25 13:32:52李青張帥王濟(jì)
        生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:小球藻毒性污染物

        李青,張帥,*,王濟(jì)

        1. 貴州師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,貴陽(yáng) 550025 2. 貴州省喀斯特山地生態(tài)環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,貴陽(yáng) 550025

        隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展,納米材料被廣泛運(yùn)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和生活中。其中納米二氧化鈦(TiO2)是應(yīng)用最廣泛納米材料之一,被用于化妝品、醫(yī)藥、涂料、遮光劑和水處理等領(lǐng)域[1-2],大量的使用及生產(chǎn),納米TiO2不可避免地進(jìn)入水環(huán)境中。多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是一種持久性有機(jī)污染物,在環(huán)境中能持久存在、遠(yuǎn)距離遷移和生物蓄積等。PCBs不僅具有生殖毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾作用和潛在的致癌作用[3],而且會(huì)造成細(xì)胞氧化損傷和基因毒性[4-5]。天然有機(jī)質(zhì)(natural organic matter, NOM)由腐殖質(zhì)和富里酸等腐殖酸類(lèi)物質(zhì)和非腐殖酸類(lèi)物質(zhì)組成[6],廣泛存在自然水體中。這幾種物質(zhì)在水環(huán)境中遷移、轉(zhuǎn)化和發(fā)生相互作用,通過(guò)食物鏈間的傳遞,會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生毒性甚至影響整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)。

        水生生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜多變,納米TiO2進(jìn)入水環(huán)境后與有機(jī)污染物及NOM復(fù)合效應(yīng)及其機(jī)理不明,因此,對(duì)二者的復(fù)合效應(yīng)及其潛在機(jī)理的研究十分必要。納米TiO2對(duì)小球藻的毒性主要?dú)w因于氧化壓力、物理?yè)p傷及遮光效應(yīng)等,此外,納米TiO2在水環(huán)境中易發(fā)生團(tuán)聚[7],吸附在藻細(xì)胞表面并抑制其生長(zhǎng),這與先前研究納米Al2O3對(duì)藻類(lèi)的毒性效應(yīng)一致[8],納米材料團(tuán)聚體會(huì)對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生一定的遮光效應(yīng),進(jìn)而抑制藻類(lèi)光合作用從而影響其生長(zhǎng),這也是納米材料對(duì)藻類(lèi)致毒機(jī)制之一。水體中廣泛存在的NOM會(huì)與納米TiO2相互作用,改變其物理化學(xué)性質(zhì)及膠體行為,進(jìn)而影響藻類(lèi)毒性。有研究表明,腐殖酸能通過(guò)減少活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成及物理?yè)p傷降低納米TiO2對(duì)藻類(lèi)的毒性[9]。有機(jī)污染物的細(xì)胞毒性主要?dú)w因于與生物大分子和細(xì)胞器的相互作用,從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝[10],例如,氯苯和PCBs引起內(nèi)分泌紊亂、DNA損傷、電子轉(zhuǎn)移與生物大分子相互作用[11]。高強(qiáng)光促使阿特拉津提高藻細(xì)胞丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,引起脂質(zhì)過(guò)氧化[12]和抑制葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ的電子轉(zhuǎn)移和固碳[13]。因此,理論上來(lái)說(shuō)納米TiO2和PCBs對(duì)生物有不同的毒性效應(yīng)和致毒機(jī)理。

        小球藻是自然水體中主要的初級(jí)生產(chǎn)者,具有繁殖能力強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、體積小,對(duì)多種毒物敏感、可直接在細(xì)胞水平上觀察等特點(diǎn),常作為受試生物來(lái)評(píng)估污染物對(duì)水生生物的毒性。目前,NOM對(duì)納米TiO2與3,3’,4,4’-四氯聯(lián)苯(3,3’,4,4’-tetrachlorobiphenyl, PCB-77)藻類(lèi)毒性影響的相關(guān)研究很少,其致毒機(jī)理未得到闡明。本文通過(guò)納米TiO2與PCB-77單獨(dú)及復(fù)合暴露在NOM存在與不存在條件下,考察其對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響和氧化損傷及其團(tuán)聚沉降。采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)、紅外差譜和實(shí)時(shí)定量PCR等方法從亞細(xì)胞和分子水平上揭示NOM對(duì)納米TiO2與PCB-77的藻類(lèi)毒性影響及致毒機(jī)理。

        1 材料與方法(Materials and methods)

        1.1 化學(xué)品和生物

        蛋白核小球藻(Chlorellavulgaris, FACHB-9)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫(kù),用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)推薦培養(yǎng)基在智能培養(yǎng)箱(廣州韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司,GZ-250-GI)中培養(yǎng)。納米TiO2為銳鈦型,粒徑為5~10 nm,純度為98%,購(gòu)于浙江弘晟材料科技股份有限公司。NOM在國(guó)際腐殖質(zhì)協(xié)會(huì)(International Humic Substances Society, IHSS)獲得,編號(hào)為2R101N。純度為99%的PCB-77購(gòu)買(mǎi)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

        1.2 NOM對(duì)納米TiO2與PCB-77單獨(dú)和復(fù)合暴露對(duì)小球藻毒性的影響

        將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻置于250 mL錐形瓶中培養(yǎng)繁殖,錐形瓶置于光照恒溫?fù)u床中培養(yǎng),瓶中為100 mL含有不同污染物的OECD培養(yǎng)基。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在110 r·min-1的搖床中進(jìn)行,未添加藻種時(shí)溶液中未沉淀的納米TiO2濃度在80%以上。培養(yǎng)條件為(25±0.5) ℃、110 r·min-1、光照度為(100±5) μE·m-2·s-1、光暗比為14 h∶10 h。藻的初始濃度設(shè)置為2×105cells·mL-1,暴露96 h后,在光學(xué)顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司,BM1000)下用血球計(jì)數(shù)板對(duì)小球藻計(jì)數(shù),得到各污染物對(duì)小球藻的96 h劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線,并用線性?xún)?nèi)插法計(jì)算出各污染物96 h半數(shù)抑制濃度(96 h-IC50)。

        藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制率實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)部分。(1)測(cè)定小球藻的單獨(dú)毒性效應(yīng)。納米TiO2和PCB-77的濃度分別為0~30 mg·L-1和0~0.01 mg·L-1,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(CK)。(2)測(cè)定納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露時(shí),NOM對(duì)小球藻毒性的影響。①NOM濃度固定為10 mg·L-1(預(yù)實(shí)驗(yàn)得出在NOM對(duì)小球藻無(wú)毒性情況下,對(duì)納米TiO2和PCB-77毒性影響最大濃度),改變納米TiO2的濃度(4、8、12、16、20和30 mg·L-1),測(cè)定NOM對(duì)納米TiO2藻類(lèi)毒性的影響。②PCB-77在溶解度范圍內(nèi)對(duì)小球藻的生長(zhǎng)抑制率低于50%(單獨(dú)毒性實(shí)驗(yàn)得出),因此PCB-77與納米TiO2復(fù)合毒性實(shí)驗(yàn)初始濃度配比為(0a, 0c)、(0.2a, 0.2b)、(0.4a, 0.4b)、(0.6a, 0.6b)、(0.8a, 0.8b)和(a, b)。其中,a、b分別為納米TiO2的參比濃度(IC50附近)和PCB-77的參比濃度(最大溶解濃度),分別為20 mg·L-1和0.01 mg·L-1。測(cè)定納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露對(duì)小球藻的毒性。③在②的基礎(chǔ)上添加NOM(10 mg·L-1),測(cè)定納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露時(shí)添加NOM對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響。每24 h對(duì)消耗的PCB-77進(jìn)行補(bǔ)充。

        1.3 NOM、納米TiO2和PCB-77與藻細(xì)胞自沉降和共沉降實(shí)驗(yàn)

        為了探究不同暴露條件下小球藻沉降情況。暴露條件和藻類(lèi)毒性實(shí)驗(yàn)的相同,納米TiO2、PCB-77和NOM的初始濃度分別為16、0.008和10 mg·L-1,小球藻初始濃度用660 nm處吸光度(A660)表示,為0.2。用紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司,UV-5500)于660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各懸浮液的吸光度(A)隨時(shí)間的變化(總沉降時(shí)間12 h)。計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)的吸光值與初始吸光值(A0)的比值A(chǔ)/A0,得到A/A0隨時(shí)間的變化規(guī)律,繪制出各暴露組自沉降與共沉降曲線,從而得到NOM存在與不存在時(shí)PCB-77對(duì)納米TiO2與小球藻自沉降與混合共沉降的影響。

        1.4 小球藻細(xì)胞氧化損傷的測(cè)定

        實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同暴露條件下培養(yǎng)24 h藻細(xì)胞中ROS、MDA、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)。暴露條件和小球藻初始濃度與毒性實(shí)驗(yàn)的相同,物質(zhì)的初始濃度與沉降實(shí)驗(yàn)的相同。MDA含量與生物體受到的氧化損壞傷密切相關(guān),用硫代巴比妥酸測(cè)定MDA的含量[14]。用氧化敏感探針5(6)-氯甲基-2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(5-(and-6)-chloromethyl-2’,7’-dichlorouorescein diacetate, CM-H2DCFDA)測(cè)定小球藻細(xì)胞內(nèi)ROS[15]。SOD和CAT是生物體的抗氧化酶,SOD是抵御機(jī)體氧化損傷的第一道防線,CAT可促使生物機(jī)體內(nèi)的H2O2分解為氧和水,使機(jī)體細(xì)胞免受H2O2的氧化損傷,消除過(guò)量的ROS,維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。測(cè)試按照SOD和CAT試劑盒說(shuō)明進(jìn)行(南京建成生物工程研究所)。

        1.5 透射電鏡觀察

        暴露條件和小球藻初始濃度與毒性實(shí)驗(yàn)的相同,物質(zhì)的初始濃度與沉降實(shí)驗(yàn)的一樣。培養(yǎng)24 h的小球藻細(xì)胞在戊二醛中固定、脫水、包埋和切片后,使用TEM(JEM-1230,日本電子公司)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化[14]。

        1.6 紅外差譜

        傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer, FTIR)分析不同暴露條件下藻細(xì)胞有關(guān)化學(xué)組分的變化。暴露條件和小球藻初始濃度與毒性實(shí)驗(yàn)的相同,物質(zhì)的初始濃度與沉降實(shí)驗(yàn)的相同。培養(yǎng)96 h后用密度平衡法分離[16]藻細(xì)胞與游離納米顆粒,將收集到的藻細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS, pH=7.0)沖洗3遍后,冷凍干燥得到待測(cè)藻粉。1 mg待測(cè)藻粉與100 mg KBr混合研磨壓片,用紅外光譜儀(Thermo Scientific Nicolet IS5,美國(guó))進(jìn)行測(cè)定,設(shè)置分辨率4 cm-1,在4 000~400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描32次,用OMINIC軟件對(duì)得到的紅外光譜進(jìn)行基線校正及歸一化處理后,進(jìn)行差譜分析。

        1.7 基因測(cè)定

        設(shè)置空白對(duì)照(CK)、PCB-77和納米TiO2復(fù)合暴露(NOM存在與不存在)實(shí)驗(yàn)組,培養(yǎng)條件和小球藻初始濃度與毒性實(shí)驗(yàn)的相同,物質(zhì)的初始濃度與沉降實(shí)驗(yàn)的相同,培養(yǎng)96 h后,離心(4 000 r·min-1、5 min、4 ℃)收集藻細(xì)胞,并用PBS(pH=7.0)清洗2遍。使用UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒(B511321,生工生物工程(上海)股份有限公司)提取總RNA,具體實(shí)驗(yàn)操作參考該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。測(cè)定提取的RNA在230 nm、260 nm和280 nm處吸光值,并計(jì)算RNA的濃度。當(dāng)A260/A280比值在1.8~2.2之間,且A260/A230比值介于2.0~2.4之間時(shí),說(shuō)明RNA純度較高。選取了13個(gè)目的基因,詳細(xì)信息如表1所示。cDNA第一鏈合成是在水浴的nuclease-free PCR管中進(jìn)行相應(yīng)的反應(yīng)后,再在PCR儀上按照相應(yīng)的條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在Step One Plus型熒光定量PCR儀(ABI公司,美國(guó))上進(jìn)行。actin作為內(nèi)參基因,相對(duì)表達(dá)含量是依據(jù)內(nèi)參actin換算的,計(jì)算公式為2-ΔΔCp[17]。

        表1 目的基因的引物序列[18-19]Table 1 Sequences of primer pairs used for real-time PCR [18-19]

        1.8 數(shù)據(jù)處理

        本研究所有樣品均設(shè)置3個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Excel 2016進(jìn)行整理及計(jì)算,在SPSS 22.0中進(jìn)行單因素ANOVA方差分析及Dancan多重比較法(差異性水平為P<0.05),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪圖使用Origin 2017完成。

        2 結(jié)果(Results)

        2.1 NOM、納米TiO2和PCB-77對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

        由圖1(a)可知,PCB-77和納米TiO2單獨(dú)脅迫小球藻96 h的生長(zhǎng)抑制率分別為19.28%和64.00%,納米TiO2對(duì)小球藻96 h-IC50是22.30 mg·L-1。納米TiO2濃度越高對(duì)小球藻產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制率越高,高濃度(30 mg·L-1)培養(yǎng)96 h后的小球藻,藻細(xì)胞發(fā)黃,錐形瓶底部有藻細(xì)胞沉底,且有藻細(xì)胞黏附在瓶壁上,這限制了藻細(xì)胞的游動(dòng),培養(yǎng)體系間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體交換也可能受到影響。由圖1(b)所示,NOM使納米TiO2對(duì)小球藻的毒性降低,降低的最大百分比是7.67%。由圖1(c)可知納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,添加NOM后小球藻的生長(zhǎng)抑制率顯著增加,增大的最大百分比為9.97%。

        2.2 NOM、納米TiO2和PCB-77對(duì)小球藻團(tuán)聚沉降的影響

        由圖2(a)所示,單獨(dú)的藻細(xì)胞與NOM存在下藻細(xì)胞的沉降曲線幾乎重合,表明NOM對(duì)藻細(xì)胞的自沉降影響可以忽略,但PCB-77單獨(dú)脅迫時(shí),小球藻沉降速率加快,說(shuō)明PCB-77對(duì)小球藻有一定的毒性。由圖2(b)所示,PCB-77對(duì)納米TiO2的自沉降無(wú)顯著影響,PCB-77對(duì)納米TiO2懸浮液穩(wěn)定性及分散性能無(wú)顯著影響[20],添加NOM后,納米TiO2和PCB-77沉降速率略微加快。由圖2(c)所示,納米TiO2與小球藻的共沉降效應(yīng)非常明顯,它們之間發(fā)生了明顯的團(tuán)聚,納米TiO2包裹在小球藻表面,加快了沉降速率。PCB-77對(duì)納米TiO2與小球藻的共沉降速率無(wú)顯著影響,雖然PCB-77對(duì)小球藻自沉降速率有影響,但并不足以影響納米TiO2與小球藻的共沉降速率,因?yàn)榧{米TiO2與小球藻的接觸異團(tuán)聚效應(yīng)較強(qiáng),且團(tuán)聚體較大,共沉降速率較快。添加NOM后,納米TiO2與PCB-77和小球藻沉降速率加快。

        2.3 NOM、納米TiO2和PCB-77對(duì)藻細(xì)胞氧化損傷的影響

        如圖3(a)和3(b)所示,MDA含量的變化趨勢(shì)與ROS的變化趨勢(shì)基本一致,暴露在納米TiO2懸浮液中,ROS和MDA的含量最高,說(shuō)明藻細(xì)胞在納米TiO2的作用下,發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化造成氧化損傷,破壞了細(xì)胞完整性。添加NOM后,藻細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量顯著降低,可能是因?yàn)镹OM覆蓋在納米TiO2表面,通過(guò)物理阻塞減少了納米顆粒與藻細(xì)胞的接觸,從而緩解了納米TiO2對(duì)藻細(xì)胞的氧化損傷。Lin等[9]報(bào)道腐殖酸能顯著降低納米TiO2引起的MDA含量。PCB-77單獨(dú)脅迫和加入NOM后,與空白實(shí)驗(yàn)組相比藻細(xì)胞中ROS和MDA含量變化都不大,說(shuō)明PCB-77和NOM對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量的影響不大。PCB-77組在加入NOM后SOD和CAT活性顯著升高,推測(cè)可能是由于PCB-77與NOM結(jié)合物對(duì)小球藻細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活性有顯著誘導(dǎo)作用,導(dǎo)致SOD和CAT基因編碼改變,使SOD和CAT活性升高[21]。復(fù)合暴露中ROS與MDA含量比單獨(dú)PCB-77脅迫時(shí)高,說(shuō)明納米TiO2是引起藻細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量變化的主力,添加NOM后與空白對(duì)照組相比較ROS和MDA含量升高較少,說(shuō)明氧化損傷不是該復(fù)合暴露組的主要致毒機(jī)理。

        圖1 各污染物單獨(dú)及復(fù)合暴露對(duì)小球藻的96 h生長(zhǎng)抑制劑量-效應(yīng)曲線注:PCB-77為3,3’,4,4’-四氯聯(lián)苯,TiO2 NPs為納米二氧化鈦,NOM為天然有機(jī)質(zhì);(a) PCB-77和TiO2 NPs對(duì)小球藻的96 h生長(zhǎng)抑制 劑量-效應(yīng)曲線,(b) NOM存在與不存在條件下TiO2 NPs單獨(dú)暴露時(shí)小球藻的96 h生長(zhǎng)抑制劑量-效應(yīng)曲線,(c) NOM存在與不存在 條件下TiO2 NPs和PCB-77復(fù)合暴露對(duì)小球藻的96 h生長(zhǎng)劑量-效應(yīng)曲線;*表示顯著性差異(P<0.05)。Fig. 1 The dose-effect curve of 96 h growth inhibition of Chlorella vulgaris by various pollutants alone or combinedNote: PCB-77 is 3,3’,4,4’-tetrachlorobiphenyl, TiO2 NPs is nano-TiO2 and NOM is natural organic matter; (a) 96 h growth inhibition dose-effect curve of PCB-77 and TiO2 NPs on Chlorella vulgaris; (b) 96 h growth inhibition dose-effect curve of TiO2 NPs on Chlorella vulgaris alone with or without NOM; (c) 96 h growth dose-effect curve of Chlorella vulgaris exposed to both TiO2 NPs and PCB-77 with or without NOM; *means significant difference (P<0.05).

        圖2 各污染物單獨(dú)及復(fù)合暴露對(duì)小球藻自沉降和共沉降的影響注:(a) PCB-77、NOM對(duì)小球藻沉降的影響;(b) PCB-77、NOM對(duì)納米TiO2沉降的影響;(c) PCB-77、NOM對(duì)納米TiO2和小球藻共沉降的影響。Fig. 2 Effects of single and combined exposure of various pollutants on the self-sedimentation and co-sedimentation of Chlorella vulgarisNote: (a) Effects of PCB-77 and NOM on Chlorella vulgaris sedimentation; (b) The effects of PCB-77 and NOM on the deposition of nano-TiO2; (c) The effect of PCB-77 and NOM on the co-sedimentation of nano-TiO2 and Chlorella vulgaris.

        生物體有自我調(diào)節(jié)能力,在氧化壓力增大時(shí),SOD與CAT的活性將提高以緩解氧化壓力[22]。因此CAT和SOD的活性與細(xì)胞受到的氧化壓力有關(guān),當(dāng)氧化壓力脅迫過(guò)高,CAT和SOD也不能完全消除氧化壓力,將產(chǎn)生氧化損傷,當(dāng)氧化損傷達(dá)到一定程度,SOD與CAT的活性下降,細(xì)胞內(nèi)ROS積累更多,細(xì)胞逐漸受損凋亡。如圖3(c)和3(d)所示,藻細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活性與MDA和ROS含量有較好的相關(guān)性,細(xì)胞所受氧化壓力較大時(shí),SOD和CAT活性由于細(xì)胞的氧化應(yīng)激而升高;MDA和ROS含量較少時(shí),SOD和CAT也相對(duì)較低。

        2.4 NOM、納米TiO2和PCB-77對(duì)小球藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的影響

        圖4為不同處理?xiàng)l件下藻細(xì)胞透射電鏡圖,空白對(duì)照組的藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞膜和細(xì)胞壁緊密結(jié)合,淀粉粒和脂滴等能量物質(zhì)比較豐富。藻細(xì)胞單獨(dú)暴露在納米TiO2懸浮液中出現(xiàn)了質(zhì)壁分離和細(xì)胞膜破損,納米TiO2能使藻細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整性受到破壞并且能使藻細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變,這與先前研究一致[23],暴露在含有NOM的納米TiO2懸浮液中的細(xì)胞形態(tài)相比較于單獨(dú)暴露在納米TiO2懸浮液中的細(xì)胞損傷更小,這與NOM降低納米TiO2的藻類(lèi)毒性結(jié)果相符。PCB-77對(duì)小球藻細(xì)胞形態(tài)影響較小,PCB-77與納米TiO2復(fù)合暴露中,藻細(xì)胞外附著大量納米TiO2,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清晰,并出現(xiàn)電子致密體,添加NOM后細(xì)胞器結(jié)構(gòu)更加不清晰,出現(xiàn)了較大的空泡結(jié)構(gòu)。有納米TiO2存在的實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)含有電子致密體和空泡的結(jié)構(gòu),而這些電子致密體和空泡結(jié)構(gòu)在其他實(shí)驗(yàn)組中并未出現(xiàn),因此可以判斷主要是由納米TiO2暴露造成。推測(cè)也可能是藻細(xì)胞對(duì)納米TiO2的胞吞行為或?qū)M(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的納米TiO2及被納米TiO2傷害細(xì)胞器的胞吐行為引起的。

        2.5 NOM、納米TiO2和PCB-77對(duì)藻細(xì)胞化學(xué)組成的影響

        圖3 各污染物單獨(dú)及復(fù)合暴露對(duì)小球藻氧化損傷的影響 注:CK為空白對(duì)照組,24 h藻細(xì)胞內(nèi)(a)活性氧(ROS)、(b)丙二醛(MDA)、(c)超氧化物歧化酶(SOD)和(d)過(guò)氧化氫酶(CAT)的測(cè)定值; 不同字母差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Fig. 3 Effects of single and combined exposure of pollutants on oxidative damage of Chlorella vulgarisNote: CK is blank control group; the intracellular (a) reactive oxygen species (ROS), (b) malondialdehyde (MDA), (c) superoxide dismutase (SOD) and (d) catalase (CAT) were measured at 24 h; the difference of different letters was statistically significant (P<0.05).

        圖4 各種污染物單獨(dú)及復(fù)合暴露24 h后小球藻的TEM照片注:圖中白實(shí)線、黑實(shí)線、白虛線、黑虛線和黑點(diǎn)劃線箭頭分別指向淀粉粒、脂滴、細(xì)胞破損處、質(zhì)壁分離處和粘附 在細(xì)胞壁上的納米TiO2,白色方框?yàn)殡娮又旅荏w和空泡結(jié)構(gòu)。Fig. 4 TEM images of Chlorella vulgaris exposed to various pollutants for 24 hNote: The arrows with white solid line, black solid line, white dashed line, black dashed line and black dotted line point to starch granules, lipid droplets, cell damage, plasma wall separation and nano-TiO2 adhered to cell wall respectively; the white box shows electron dense body and vacuole structure.

        圖5 各種污染物單獨(dú)及復(fù)合暴露組小球藻的紅外差譜注:(a) NOM存在與不存在條件下納米TiO2單獨(dú)暴露組和空白組藻細(xì)胞的紅外差譜;(b) NOM存在與不存在條件下PCB-77單獨(dú) 和納米TiO2復(fù)合暴露組藻細(xì)胞的紅外差譜。Fig. 5 Infrared difference spectra of Chlorella vulgaris exposed to various pollutants alone or in combinationNote: (a) Infrared difference spectrum of algae cells exposed to nano-TiO2 with or without NOM; (b) Infrared difference spectrum of algae cells exposed to PCB-77 with or without NOM.

        2.6 NOM、納米TiO2和PCB-77對(duì)藻細(xì)胞基因表達(dá)的影響

        在NOM存在或不存在條件下,納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)13個(gè)基因表達(dá)的影響如圖6所示。所選基因參與調(diào)控藻細(xì)胞的脂肪合成、光合作用、細(xì)胞呼吸及細(xì)胞分裂。乙酰CoA羧化酶和二?;视突D(zhuǎn)移酶分別為催化TAG合成的第一步和最后一步關(guān)鍵步驟,如圖6所示,納米TiO2和PCB-77復(fù)合暴露中,基因accA、accD、dgat7494和dgat3280表達(dá)量下降,說(shuō)明納米TiO2和PCB-77復(fù)合處理藻細(xì)胞抑制TAG的合成與積累,添加NOM后,此相關(guān)基因accA、accD、dgat7494和dgat3280表達(dá)量顯著上升,NOM能促進(jìn)TAG的合成與積累。復(fù)合暴露組中基因ME的表達(dá)量都顯著上調(diào),說(shuō)明蘋(píng)果酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化加快,導(dǎo)致蘋(píng)果酸含量降低,NOM使蘋(píng)果酸含量下降更加迅速。磷酸烯醇式丙酮(PEP)酸羧化酶固定CO2產(chǎn)生草酰乙酸(OAA),經(jīng)NADP專(zhuān)一的蘋(píng)果酸脫氫酶催化形成蘋(píng)果酸。在細(xì)胞葉綠體中的NADP蘋(píng)果酸酶催化形成丙酮酸和釋放CO2,CO2通過(guò)卡爾文環(huán)固定產(chǎn)生3-磷酸甘油酸(PGA),再轉(zhuǎn)化為糖和淀粉。NOM使基因PEPC表達(dá)量顯著下降表明藻細(xì)胞中蘋(píng)果酸沒(méi)有得到及時(shí)補(bǔ)充,使藻細(xì)胞中糖和淀粉含量降低。CAH2和rbcL這2種基因主要參與光合作用的碳固定反應(yīng),不同暴露組中藻細(xì)胞內(nèi)這2個(gè)基因的表達(dá)量均顯著降低,參與光合作用光反應(yīng)的基因psbB

        的表達(dá)量變化不大,編碼無(wú)機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HLA3的表達(dá)量顯著下降,參與ATP合成的葉綠體基因atpB略微下降,這幾種基因表達(dá)量下降表明納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露在NOM存在或不存在條件下都抑制了藻細(xì)胞光合作用。cox2表達(dá)量降低,細(xì)胞色素C氧化酶是線粒體內(nèi)膜上呼吸功能鏈末端的特征峰,參與氧化磷酸化過(guò)程,說(shuō)明線粒體呼吸功能受到影響。細(xì)胞分裂蛋白基因ftsH表達(dá)量下降,表明納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露影響了小球藻分裂??梢?jiàn)納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露在NOM存在或不存在條件下均抑制或破壞小球藻光合作用、細(xì)胞呼吸和細(xì)胞分裂,導(dǎo)致ATP合成減少,進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

        3 討論(Discussion)

        圖6 NOM存在與不存在條件下納米TiO2和PCB-77復(fù)合暴露對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)13個(gè)基因的mRNA相對(duì)含量的影響注:不同字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Fig. 6 The mRNA relative levels of 13 genes in algal cells with and without NOM exposed to nano-TiO2 and PCB-77Note: Different letters indicate statistically significant differences (P<0.05).

        納米顆粒與藻細(xì)胞的團(tuán)聚沉降可影響小球藻的生長(zhǎng)速率,這也是納米材料對(duì)藻類(lèi)致毒機(jī)理之一[14]。納米TiO2在水環(huán)境中易發(fā)生團(tuán)聚,在與小球藻共暴露的過(guò)程中,納米TiO2團(tuán)聚體吸附到藻細(xì)胞表面,對(duì)藻細(xì)胞有一定的纏繞作用,限制了藻細(xì)胞的游動(dòng),使細(xì)胞間產(chǎn)生相互遮蔽,阻礙藻細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及光的吸收,進(jìn)而加快藻細(xì)胞團(tuán)聚沉降,影響藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。這與納米TiO2對(duì)月牙藻的毒性作用機(jī)理一致[32]。納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露中NOM存在加快小球藻沉降,團(tuán)聚體包裹著小球藻,抑制小球藻的光合作用,影響藻細(xì)胞呼吸,進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性,與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因結(jié)果相符。從TEM照片中看出,復(fù)合暴露中藻細(xì)胞外包裹有大量的納米TiO2,藻細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清晰,并且出現(xiàn)電子致密體,NOM存在使藻細(xì)胞質(zhì)壁分離嚴(yán)重并出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu),紅外差譜分析中,納米TiO2與PCB-77單獨(dú)及復(fù)合暴露在NOM存在時(shí)引起小球藻脂質(zhì)、糖類(lèi)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化,因此,推測(cè)復(fù)合污染物與小球藻直接接觸是導(dǎo)致毒性的一個(gè)重要原因。小球藻在受到污染物脅迫時(shí)會(huì)直接產(chǎn)生大量的ROS造成藻細(xì)胞氧化損傷,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量過(guò)高時(shí),會(huì)與細(xì)胞膜組織或細(xì)胞器膜脂質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化,同時(shí)細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生抗氧化酶SOD和CAT來(lái)緩解細(xì)胞氧化損傷,但當(dāng)ROS含量過(guò)高時(shí),抗氧化酶也不能完全消除氧化壓力,從而引起藻細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁損傷,發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象。研究表明,增大細(xì)胞氧化脅迫是納米TiO2致毒機(jī)理之一,且隨納米TiO2濃度增加細(xì)胞受到氧化脅迫增加[33],納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露在NOM存在條件下,與空白對(duì)照組相比ROS和MDA含量變化不顯著,推測(cè)氧化損傷不是該復(fù)合組的主要致毒途徑,該復(fù)合組對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響主要是團(tuán)聚沉降產(chǎn)生的遮蔽效應(yīng)及接觸性物理?yè)p傷。

        圖7 NOM、納米TiO2和PCB-77對(duì)小球藻致毒機(jī)理示意圖Fig. 7 Toxic mechanism of NOM, nano-TiO2 and PCB-77 on Chlorella vulgaris

        根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,總結(jié)NOM、納米TiO2和PCB-77對(duì)小球藻的致毒機(jī)制如圖7所示。納米TiO2團(tuán)聚體吸附在小球藻表面,纏繞著藻細(xì)胞,影響藻細(xì)胞光合作用、細(xì)胞呼吸以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,從TEM中觀察到,復(fù)合暴露中藻細(xì)胞外包裹有大量的納米TiO2,導(dǎo)致藻細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清晰,并且出現(xiàn)電子致密體,當(dāng)NOM存在時(shí)藻細(xì)胞質(zhì)壁分離嚴(yán)重并出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu),進(jìn)而造成細(xì)胞凋亡,NOM存在時(shí)復(fù)合毒性增大的原因主要是遮蔽效應(yīng)和接觸性物理?yè)p傷。ROS會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化,造成細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膜損傷以及生物大分子變性。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量較低時(shí),藻細(xì)胞中SOD和CAT酶能消除氧化壓力保護(hù)藻細(xì)胞免受損傷,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量較高時(shí),SOD與CAT酶不能消除氧化壓力時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS積累更多,就會(huì)出現(xiàn)上述的不良反應(yīng),之前研究表明,增大細(xì)胞氧化壓力是納米TiO2致毒機(jī)理之一[33]。由PCR結(jié)果可知,納米TiO2與PCB-77復(fù)合暴露在NOM存在與不存在條件下,能誘導(dǎo)或抑制特定基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控相關(guān)酶和蛋白質(zhì)的合成和表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞呼吸、光合作用以及細(xì)胞代謝,最終影響細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。當(dāng)藻細(xì)胞在受到這些污染物脅迫時(shí)還會(huì)引發(fā)一些保護(hù)性反應(yīng)來(lái)維持正常的細(xì)胞功能,包括滲透壓調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜流動(dòng)性以及細(xì)胞分裂等。當(dāng)這些保護(hù)性反應(yīng)無(wú)法抵御污染物的進(jìn)攻時(shí),就會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清晰、質(zhì)壁分離、生物大分子變性失活以及光合作用和細(xì)胞呼吸受阻造成能量代謝紊亂等破壞性反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞毒性,造成細(xì)胞凋亡。

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