周君薇，張麗娟，周宇昆，張效偉,3,*

1. 江蘇省環(huán)境經濟技術國際合作中心，南京 210000 2. 南京大學環(huán)境學院，南京 210023 3. 江蘇省生態(tài)環(huán)境保護化學品安全與健康風險研究重點實驗室，南京 210023

藍藻大量繁殖所形成的有毒水華嚴重威脅飲用水安全，是全球性環(huán)境問題。水庫與湖泊是世界各國重要的公共給水水源之一。隨著國民經濟與社會的發(fā)展，湖泊富營養(yǎng)化加劇，藻類水華暴發(fā)頻率增高，富營養(yǎng)化是我國湖泊的主要問題，成為制約流域社會經濟持續(xù)發(fā)展的環(huán)境問題[1]。富營養(yǎng)化的淡水中，藍藻是水體中水華的主要組成，藍藻中包含了多種具有產生毒素及嗅味物質這2類代謝物的藻種[2]，例如：微囊藻(Microcystisspp.)、柱孢藻(Cylindrospermosisspp.)等，會產生微囊藻毒素(microcystin, MC)、柱孢藻毒素(cylindrospermopsin, CYN)和蛤蚌毒素(saxitoxin, STX)等；魚腥藻(Anabaenaspp.)、假魚腥藻(Pseudanabaenaspp.)等會產生土臭素(geosmin)、2-甲基異茨醇(2-methylisoborneol, 2-MIB)等嗅味物質。當飲用水源中存在藻類毒素與嗅味物質時，除了影響飲用水的安全外，對飲用水的水質會產生影響，因此是管理及供水部門面臨的重要議題。

太湖是我國受藍藻水華暴發(fā)影響水質安全問題最突出的地區(qū)。太湖周邊經濟發(fā)達的重要城鎮(zhèn)高度依賴太湖水資源，而近年來太湖卻深受藍藻水華的影響。為了有效管理太湖的水資源，基于藻藍素及葉綠素監(jiān)測的藍藻在線自動監(jiān)測系統(tǒng)被廣泛應用，以便實時了解水體中藍藻數(shù)量，達到預警目的。然而許多環(huán)境樣品分析研究指出，同一藻種的藍藻中，可分為具有產毒能力和不具產毒能力的藍藻，兩者不僅時常同時存在[3-5]，且從形態(tài)學上無法區(qū)分[6]，因此準確辨別藍藻種類至關重要。

基于DNA的分子檢測方法為環(huán)境生物監(jiān)測提供了精準高效的替代技術。有別于傳統(tǒng)生物性監(jiān)測(如藍藻顯微鏡鏡檢)，實時熒光定量PCR(qPCR)技術是發(fā)展相對更為健全且能廣泛運用的生物監(jiān)測方法。通過專一性的引子(primer)和探針(probe)，得以快速了解當下污染物種類(定性)及污染程度(定量)。因此，可依據(jù)藍藻產生藻類毒素及嗅味物質的生化反應途徑，找出合適的功能性基因，以qPCR快速定量水體中具有產生藻類毒素/嗅味物質能力的藍藻數(shù)量，可作為分析水體中二次代謝物存在程度的依據(jù)。同時整合傳統(tǒng)分析法(毒素的ELISA法及嗅味素的SPME-GC-MS法)與qPCR定量系統(tǒng)的分析結果，可找出藻類代謝物與基因量、藍藻細胞數(shù)之間的相關性，大幅提高藻類計數(shù)的時效性[7-8]，也可克服傳統(tǒng)分析方法的缺點，如耗時過長、無法清楚區(qū)分藻種以及無法利用肉眼判斷藻種是否產生毒素或嗅味物質等。

盡管分子監(jiān)測技術已經取得長足進步，如何將其應用于水生態(tài)環(huán)境管理仍然面臨挑戰(zhàn)。在過去20年間，有許多研究都在利用qPCR技術定量產毒及產臭基因區(qū)段。在產MC基因方面，qPCR的分析結果與MC有良好的相關性[9-16]；在產CYN基因方面，亦有許多研究都在利用qPCR來定量產毒柱孢藻的數(shù)量[11-20]；而在產2-MIB基因方面，以qPCR定量產2-MIB基因的研究相對較少[21-22]。本研究重點將應用基于qPCR技術的快速分子監(jiān)測技術，分析產毒微囊藻、產毒柱孢藻和產2-MIB基因；同時采用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)分析MC和CYN這2種毒素，并用氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)分析嗅味物質2-MIB。2019年7—12月開展連續(xù)監(jiān)測，建立太湖本土化水源地的相關數(shù)據(jù)庫，以便實時掌握太湖水體中藻類毒素及嗅味物質的潛在風險，及時將分析結果反饋給管理部門，讓管理部門有足夠的時間啟動緊急應變程序，為水源安全提供快速且有效的保障。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集點位

根據(jù)江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心針對太湖全區(qū)水質監(jiān)測的例行點位進行采樣，采樣點位均勻分布于全湖各處(圖1)，總共24個采樣點。太湖是典型的淺水性湖泊，采樣點水深都在2 m左右，采樣深度<0.5 m。由于夏季氣溫高，適合藍藻大量生長，為了解不同季節(jié)藍藻的狀況及分布，2019年7—12月，每月采樣1次，其中8月及9月為太湖水華好發(fā)期，因此這2個月額外增加一次采樣，共8次采樣。

1.2 DNA提取方法

為有效達到破壞藻體細胞壁的目的，在DNA提取前利用玻璃珠破壁技術。將10 mL樣品過濾至0.22 μm的醋酸纖維濾紙后，置于1.5 mL的離心管中，而后于離心管中加入400 μL緩沖液，利用振蕩器(SI-G560, Vortex-Gene 2, Scientific Industries，美國)震蕩10 min，在65 ℃溫度下反應10 min后，便可開始進行DNA提取。DNA的提取則選用植物基因組DNA提取微型套組(DNA-0301, Plant Genomic DNA Extraction Mini Kit，綠準生物科技有限公司，中國)，最后可取得100 μL的DNA提取液。

1.3 qPCR定量系統(tǒng)

利用實時定量聚合酶鏈式反應(qPCR) (CFX Connect, Real-Time PCR Detection System, BIO-RAD，美國)進行目標基因的定量分析。qPCR操作條件：首先以95 ℃預先反應300 s，之后開始進行循環(huán)放大步驟，每次循環(huán)包括95 ℃下變性10 s、60 ℃下接合20 s，此步驟重復40個循環(huán)，并于單次循環(huán)結束后獲得波長519 nm的熒光強度值。本研究采用功能性基因作為藍藻定量標準，參照Chiu等[7, 22]的研究方法，將包含產毒微囊藻基因、產毒柱孢藻基因和產2-MIB基因，以10倍序列稀釋取得各濃度標樣，測定范圍如表1所示。

1.4 藻類毒素的定量分析

采用商品化的盤式酶聯(lián)免疫套組(ELISA Kit)(微囊藻毒PN 520012、柱孢藻毒PN 522011，Abraix LLC，美國)[23]，參照套組所附的標準作業(yè)程序進行分析，用多孔吸光分光亮度儀(Multiskan FC，Thermo Scientific，芬蘭)在450 nm波長下取得吸光值，并經由標準曲線回推取得MC和CYN濃度。樣品分析前，先以快速冷凍破壁技術進行樣品前處理，利用液態(tài)氮快速凍溶方式，確保目標微生物體得到有效破壞，使藻體內部的藻毒素完全釋出到水體中，再經0.22 μm濾膜過濾，去除樣品中細胞殘骸等懸浮性物質，以免干擾后續(xù)分析。

圖1 太湖監(jiān)測點位分布圖Fig. 1 Distribution map of routine monitoring points in Lake Tai

1.5 嗅味素的定量分析

參照Lin等[24]的方法，于50 mL的樣品中加入15 g的氯化鈉，以固相微萃取法(solid phase micro-extraction, SPME)于65oC恒溫水浴下吸附30 min，將水樣中嗅味物質吸附于吸附纖維上，再用GC-MS(6890/5973，安捷倫，美國)，將吸附完畢的吸附針注入GC-MS，定量分析嗅味素。

1.6 分析靈敏度與質量控制

分析技術的質量控制(quality control)規(guī)范如表2所示，用以確認分析是否受到環(huán)境基質干擾。

1.7 統(tǒng)計分析

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件(IBM，美國)針對傳統(tǒng)分析法與qPCR技術的結果進行線性回歸分析，同時用公式(1)計算線性回歸在95%置信水平下的預期區(qū)間[25]。

(1)

表1 分析方法測值范圍Table 1 Concentration range for each analytical method

表2 樣品質量控制規(guī)范Table 2 Quality control for sample measurement

利用皮爾遜相關系數(shù)γ(Pearson’s Correlation Coefficient)分析基因和藻類毒素、嗅味物質的相關性。當相關系數(shù)為0.3以下時為低相關，0.3～0.7為中等相關，0.7以上為高度相關。

2 結果(Results)

2.1 太湖藍藻基因和代謝物的時空分布2.2.1 藍藻產毒基因的時空分布

太湖產毒微囊藻基因的拷貝數(shù)范圍為55～2.48×107copy·mL-1，平均值為7.83×105copy·mL-1。產毒微囊藻基因具有明顯的時空分布特征。時間上，產毒微囊藻基因的豐度在7、8月不斷上升，9月達到最高值，10—12月逐漸下降(圖2(a))?？臻g上，產毒微囊藻基因呈現(xiàn)出西部最高，北部次之的空間分布特征，其中太湖西北部的竺山湖心7月的產毒微囊藻基因的拷貝數(shù)達到2.48×107copy·mL-1，北部的梅梁灣在9月上旬的產毒微囊藻基因的拷貝數(shù)達到1.24×107copy·mL-1(圖3)。

太湖產毒柱孢藻基因的拷貝數(shù)介于ND～1.96×106copy·mL-1，平均值為2.99×104copy·mL-1，明顯低于產微囊藻毒素基因。太湖產毒柱孢藻基因在7、8月達到最高值，9—12月逐漸下降(圖2(b))?？傊咴寤蚝彤a毒柱孢藻基因具有相似的時間分布規(guī)律，產毒柱孢藻基因/總柱孢藻基因的比值范圍為4.1%～100%，平均值為88.9%，說明絕大多數(shù)柱孢藻都含有產毒素的基因。產毒柱孢藻基因顯示區(qū)域性分布差異，北部和東部的產毒藻基因的拷貝數(shù)較高，如太湖東北部的五里湖心在7—11月的藻毒素基因的拷貝數(shù)均高于3.98×104copy·mL-1(圖4)，明顯高于其他點位。

太湖產2-MIB基因豐度介于ND～2.11×106copy·mL-1之間，平均濃度為1.52×102copy·mL-1，其濃度在7、8月維持較高水平，9月開始不斷下降(圖2(c))。空間上，東部(尤其東南區(qū))的產2-MIB基因濃度較高，其中7月東南部廟港的產2-MIB基因濃度最高，8月上旬漾西港的濃度達到4.19×106copy·mL-1(圖5)。

2.2.2 藍藻毒素、嗅味物質的時空分布

MC太湖檢出的平均濃度為4.1 μg·L-1，最高濃度出現(xiàn)在9月下旬的東部位點新塘港，達到674.47 μg·L-1，其余位點的濃度均低于10 μg·L-1。MC和產毒微囊藻基因具有相似的時空分布特征。時間上，MC在9月上旬達到最高值，之后逐漸下降?？臻g上，MC的平均值也呈現(xiàn)出以西區(qū)(尤其西北部)較高的分布格局，其中9月上旬有6個采樣位點的MC濃度高于世界衛(wèi)生組織推薦的標準(1 μg·L-1)，均位于太湖西部和北部，竺山湖和梅梁湖的濃度最高，分別達到7.53 μg·L-1和6.22 μg·L-1。

CYN在太湖的檢出范圍為ND～1.5 μg·L-1，平均濃度為0.2 μg·L-1。相比產毒柱孢藻基因，CYN隨著時間的變化滯后，在7—9月濃度較高，之后逐漸下降(圖2(b))。CYN和產柱孢藻基因的空間分布格局相似(圖4)，東部和南部的濃度明顯高于其他區(qū)域，其中五里湖、西山西和澤山3個點位在8月下旬檢出濃度偏高，分別達到1.50、1.17和1.02 μg·L-1。

太湖2-MIB嗅味物質整體濃度范圍介于ND～1 122.8 ng·L-1，平均濃度為41.2 ng·L-1。2-MIB嗅味物質和基因濃度隨時間的分布一致，均在8月達到峰值，之后逐漸下降(圖2(c))。2-MIB在太湖東部(尤其東南部)的濃度較高，另外7—9月在太湖北部竺山湖和梅梁灣也檢出較高濃度的2-MIB(圖5)。

2.2 太湖藍藻產毒基因預測代謝產物

產毒微囊藻基因與MC濃度具有中等相關性，皮爾遜相關系數(shù)γ為0.572 (P<0.01；圖6(a))，其中有95.5%的數(shù)據(jù)會落在95%的預測區(qū)間內。同樣地，產毒柱孢藻基因與CYN濃度呈中等相關，其皮爾遜相關系數(shù)γ為0.504 (P<0.01；圖6(b))，其中有94.8%的數(shù)據(jù)會落在95%的預測區(qū)間內。而在2-MIB方面，產2-MIB基因與2-MIB濃度有中度到強度的相關性，其皮爾遜相關系數(shù)γ為0.652 (P<0.01；圖6(c))，其中有97.2%的數(shù)據(jù)會落在95%的預測區(qū)間內。由相關性分析獲得的相關公式可用于后續(xù)由基因濃度判斷藻類毒素或是嗅味物質濃度的主要參數(shù)。

2.3 太湖藍藻污染的環(huán)境影響因素

總微囊藻基因與pH呈顯著正相關，與電導率呈顯著負相關，產毒微囊藻和MC與溶解氧均呈顯著負相關。柱孢藻基因未呈現(xiàn)出和環(huán)境因子的顯著相關性，但是柱孢藻毒素呈現(xiàn)出與pH顯著正相關，與電導率顯著負相關。產2-MIB基因和嗅味物質均呈現(xiàn)與溫度顯著正相關(表3)。

圖2 各月份藍藻基因、毒素及嗅味物質的濃度變化Fig. 2 Concentration distribution of cyanobacteria gene, toxins and odorants in different months

時間Time7月July8月上旬Early August8月下旬Late August9月上旬Early September基因/(copy·mL-1)Gene/(copy·mL-1)產毒微囊藻基因Microcystin-producing gene of MicrocystisMC時間Time9月下旬Late September10月October11月November12月December微囊藻毒素/(μg·L-1)Microcystins/(μg·L-1)產毒微囊藻基因Microcystin-producing gene of MicrocystisMC

時間Time7月July8月上旬Early August8月下旬Late August9月上旬Early September基因/(copy·mL-1)Gene/(copy·mL-1)產毒柱孢藻基因Cylindrospermopsin-producing gene of CylindrospermosisCYN時間Time9月下旬Late September10月October11月November12月December柱孢藻毒素/(μg·L-1)Cylindrospermopsin/(μg·L-1)產毒柱孢藻基因Cylindrospermopsin-producing gene of CylindrospermosisCYN

時間Time7月July8月上旬Early August8月下旬Late August9月上旬Early September基因/(copy·mL-1)Gene/(copy·mL-1)產2-MIB基因2-MIB synthesis gene2-MIB時間Time9月下旬Late September10月October11月November12月December嗅味物質/(ng·L-1)Odorant/(ng·L-1)產2-MIB基因2-MIB synthesis gene2-MIB

圖6 太湖藍藻各基因與其代謝物的相關性分析注：(a) N=177；(b) N=100；(c) N=108；基因單位為copy·mL-1，MC和CYN濃度單位為μg·L-1，2-MIB濃度單位為ng·L-1。Fig. 6 Correlation analysis of genes and metabolites of cyanobacteria in Lake TaiNote: (a) N=177; (b) N=100; (c) N=108; the units of genes were copy·mL-1, the units of concentrations of MC and CYN were μg·L-1，the units of 2-MIB concentrations were ng·L-1.

3 討論(Discussion)

不同類型的產毒藻基因在太湖具有顯著的時空分布差異。時間上，產毒微囊藻基因在9月達到濃度峰值，產毒柱孢藻和產2-MIB基因則在7、8月維持較高濃度?？臻g上，產毒微囊藻基因在西部(尤其西北部)的拷貝數(shù)更高，已有研究也表明，太湖西北部藍藻水華暴發(fā)頻繁，這可能由西北部的地理位置、沉積環(huán)境及入湖河流的污染等多種因素綜合導致。產毒柱孢藻基因在北部和東部的拷貝數(shù)更高，產2-MIB基因則在東部(尤其東南部)的拷貝數(shù)更高。

太湖各項藍藻產毒基因與二次代謝物具有良好相關性。藍藻的基因和代謝產物的相關性系數(shù)反映了單位產毒基因表達轉化成毒素/嗅味的能力，相關性系數(shù)越高，代表具有產毒基因的藍藻產生毒素/嗅味的能力越強，反之亦然。太湖3種藍藻產毒基因和其代謝產物均呈中度相關，說明基于產毒微囊藻基因的豐度可以有效預警藍藻污染，并推測藍藻的生成趨勢。不同藍藻基因和代謝物受環(huán)境因子的影響不同，產毒微囊藻和微囊藻毒素和溶解氧均呈顯著負相關，柱孢藻毒素呈現(xiàn)出和pH顯著正相關，和電導率顯著負相關。產2-MIB基因和嗅味物質均呈現(xiàn)與溫度顯著正相關。

表3 藍藻基因/毒素/嗅味與環(huán)境因子的相關性Table 3 Correlation between cyanobacteria genes/toxins/odorants and environmental factors

太湖藍藻的毒素、嗅味物質和相應基因在時空上的分布格局相似。太湖產毒微囊藻基因與微囊藻毒素的線性回歸模型的斜率為0.0936，與Chiu等[7]報道的斜率(0.374)[11]有差異。中國太湖產毒柱孢藻基因與柱孢藻毒素的回歸斜率為0.0411 (圖6(b))，有異于中國臺灣地區(qū)的斜率(0.142)；而在2-MIB方面，中國太湖2-MIB的回歸斜率為0.291，小于中國臺灣地區(qū)的斜率[22]。以上結果表明，中國太湖的產毒微囊藻、產毒柱孢藻和產2-MIB的藍藻在生理特性與中國臺灣地區(qū)的有明顯的差異，中國太湖地區(qū)的斜率普遍小于中國臺灣地區(qū)的，可知在同一基因水平上中國臺灣地區(qū)的藍藻毒素及嗅味問題較太湖更為嚴峻。

目前太湖藍藻的研究仍集中在微囊藻及毒素方面，太湖中微囊藻毒素的平均濃度達4.1 μg·L-1，明顯高于柱孢藻毒素(0.2 μg·L-1)和2-MB(41.2 ng·L-1)，表明太湖藍藻水華主要由微囊藻導致，但是柱孢藻毒素在太湖的局部區(qū)域構成低風險，其在五里湖、西山西和澤山3個點位在8月下旬檢出濃度分別達到1.50、1.17和1.02 μg·L-1，超過澳洲飲用水的建議值1 μg·L-1[26-27]，建議加強對太湖其他產毒藍藻的研究。此外，太湖8月上旬和下旬分別有21個和22個點位的2-MIB濃度高于我國的建議值10 ng·L-1[28]，而所有樣品中有53%高于我國建議限值，最大濃度(1 123 ng·L-1)更遠高于我國建議限值，為限值的112倍，說明太湖存在較高的2-MIB風險。2-MIB影響飲用水水質，且在水體中不易快速降解，建議持續(xù)關注產2-MIB基因及嗅味物質的濃度變化。

太湖的飲用水源地2-MIB風險顯著高于MC和CYN。本研究共設置了5個飲用水源地點位，分別為寺前、漁洋山、金墅港、錫東水廠和廟港。相比其他采樣點，飲用水源地的MC濃度較低，產毒微囊藻基因的豐度范圍為55.4～1.73×106copy·mL-1，MC濃度均低于飲用水推薦濃度1 μg·L-1，其中錫東水廠和漁洋山的產毒微囊藻基因和MC濃度略高于其他飲用水點位，9月的MC濃度高于其他月份。飲用水源地的CYN濃度范圍為0～0.86 μg·L-1，7、8月的濃度偏高，其中廟港和漁洋山的濃度略高于其他水源地。毒素2-MIB的濃度范圍為0～412.46 ng·L-1，其中有65%的樣品濃度高于我國建議限值10 ng·L-1，8、9月的濃度偏高，尤其在廟港、漁洋山和金墅港，說明太湖的飲用水源地存在較高的2-MIB風險，可能威脅到飲用水供應安全，應該重點關注。

與傳統(tǒng)形態(tài)學相比，分子監(jiān)測方法具有檢測限低、檢測范圍廣等技術優(yōu)勢。本研究以產毒微囊藻基因、產毒柱孢藻基因和產2-MIB基因為靶向基因，通過qPCR方法定量檢測7—12月太湖產生藻類毒素/嗅味物質的藍藻數(shù)量。qPCR技術定量藍藻基因的檢測區(qū)間為2.5 ×101～2.5×107copy·mL-1，同時提供不同功能性基因的豐度變化。結果顯示，產毒微囊藻基因的平均拷貝數(shù)最高，達到7.83×105copy·mL-1，產毒柱孢藻基因次之(2.99×104copy·mL-1)，產2-MIB基因的拷貝數(shù)較低，為1.52×102copy·mL-1?？偽⒛以宓幕蚩截悢?shù)(16S rDNA基因檢測)隨時間變化趨勢與產毒微囊藻的基本一致，每月檢測到的產毒微囊藻基因均低于總微囊藻的，說明自然水體中同一藍藻物種的有毒和無毒菌株通常共存。產毒微囊藻基因/總微囊藻基因的比值為7.6%～35.9%，說明仍有高豐度的微囊藻菌株不具有產藻毒素的潛力。相反，產毒柱孢藻基因/總柱孢藻基因的比值范圍為4.1%～100%，平均值為88.9%，說明絕大多數(shù)柱孢藻都含有產毒素的基因。因此，采用產毒基因的拷貝數(shù)預測藻種的產毒能力更加準確。

本研究通過qPCR技術對太湖的3種關鍵產毒基因進行連續(xù)系統(tǒng)的監(jiān)測與分析，發(fā)現(xiàn)產毒基因和基于傳統(tǒng)方法監(jiān)測的毒素、嗅味濃度具有較高的相關性，證明基于DNA的分子檢測方法可快速準確地對產毒藻進行監(jiān)測和預警，為管理部門進行藍藻水華風險評估和管理提供技術和數(shù)據(jù)支撐，對保障該區(qū)域的飲用水安全具有重要意義。