郝玉偉，邢露勻，曹夢涵，畢晶晶

(河南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

隨著對腫瘤免疫認(rèn)識和T細(xì)胞識別機制的突破性研究進展，神經(jīng)鞘糖脂在腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移的診治和預(yù)防中開辟了一條全新的免疫治療途徑[1-3]。1990年代初，日本麒麟啤酒有限公司從沖繩海綿Agelas Mauritianus的提取物中篩選出一系列鞘糖酯類化合物，并命名為Agelasphins (AGLs)[4]。它們是D-半乳糖以α-糖苷鍵與神經(jīng)酰胺類化合物連接而成。其中α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-GalCer，KRN7000)作為明星分子，受到廣泛關(guān)注[5-7]。研究表明α-GalCer具有抗腫瘤及激活免疫作用，能通過激活NKT細(xì)胞參與多種自身免疫性疾病、腫瘤、動脈粥狀硬化和感染性疾病的免疫調(diào)節(jié)中，它作為抗癌新藥已進入Ⅰ期臨床研究階段，是藥物學(xué)家關(guān)注的重要免疫調(diào)節(jié)劑[8-9]。

KRN7000通常是由半乳糖基供體和神經(jīng)酰胺受體通過糖苷反應(yīng)構(gòu)建骨架，進而脫除各種保護基而成。所以對于KRN7000的合成來說，需要構(gòu)建糖基化反應(yīng)的供體和受體兩個模塊。近年來，對KRN7000的合成研究主要有如下幾種方法。如TAKIKAWA等[10]通過1-氟-2,3,4,6-四-氧-芐基-α-D-半乳吡喃糖與2-(N-二十六烷?；被?-3,4-二-O-叔丁基二甲基硅基-植物鞘氨醇在SnCl4/AgClO4的催化下以四氫呋喃(THF)為溶劑在-10 ℃下進行偶聯(lián)反應(yīng)(收率為53%)。KIM等[11]通過2,3,4,6-四-氧-芐基-α-D-半乳吡喃糖施密特試劑與2-(N-二十六烷酰基氨基)-3,4-二-O-叔丁基二甲基硅基-植物鞘氨醇在三氟化硼乙醚(BF3·Et2O)的催化下，以THF-Et2O為溶劑在-20 ℃下進行偶聯(lián)反應(yīng)(收率為63%)。通過2,3,4,6-四-氧-芐基-α-D-半乳吡喃糖施密特試劑與2-(N-二十六烷酰基氨基)-3,4-二-O-苯甲?；?植物鞘氨醇在三氟甲磺酸三甲硅酯(TMSOTf)的催化下，以THF-Et2O為溶劑在-23 ℃下進行偶聯(lián)反應(yīng)(收率為59%)。DU等[12]通過1-碘代-2,3,4,6-四-氧-芐基-α-D-半乳吡喃糖與2-疊氮基-3,4-二-O-對甲氧基芐基-植物鞘氨醇在四丁基碘化銨-N,N-二異丙基乙胺(TBAI-DIEA)的作用下以苯為溶劑在65 ℃下加熱進行偶聯(lián)反應(yīng)。

以上方法用到的糖基供體為氟代糖、碘代糖或者施密特試劑，它們的穩(wěn)定性相對較差，合成步驟長且復(fù)雜，不適合工業(yè)大批量合成，保存條件相對來說更加苛刻[13-15]。硫苷糖的穩(wěn)定性相對較高，不易變質(zhì)，很容易大批量合成和保存。且前三種方法需要在低溫條件下進行偶聯(lián)反應(yīng)，第四種方法所用的受體需要將植物鞘氨醇的氨基進行疊氮化，偶聯(lián)后得到α-GalCer骨架后還需要在經(jīng)過氨基化、酰胺化和脫保護才能得到目標(biāo)化合物。總體路線長，收率偏低。因此本研究嘗試了一種新的合成路線，以2,3,4,6-四-氧-芐基-α-D-半乳吡喃糖硫苷作為一種穩(wěn)定易得的糖基供體，與2-(N-二十六烷?；被?-3,4-二-O-苯甲酰基-植物鞘氨醇在N-碘代丁二酰亞胺(NIS)/TMSOTf的作用下以二氯甲烷為溶劑在0 ℃下進行偶聯(lián)反應(yīng)，進而在甲醇鈉的作用下脫除苯甲?；?，在H2，Pd(OH)2/C的作用下脫除芐基，即可獲得KRN7000，總共3步，總收率達57.3%。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

N-碘代丁二酰亞胺(北京百靈威科技有限公司)，二氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯(天津市德恩化學(xué)試劑有限公司)，0.4 nm分子篩、三甲基硅基三氟甲基磺酸酯、Pd(OH)2/C(北京伊諾凱科技有限公司)，三乙胺(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，Na2S2O3、甲醇鈉(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，酸性樹脂IR-120(鄭州阿爾法化工有限公司)，以上藥品均為分析純。

R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，核磁共振儀-Avance 400 MHz (瑞士布魯克公司)，Bruker micro ToF II高分辨率質(zhì)譜(德國布魯克公司)，BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(鄭州國瑞儀器有限公司)，ZF-20D暗箱式紫外分析儀(鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1KRN7000的合成原理

以2,3,4,6-四-氧-芐基-α-D-半乳吡喃糖硫苷與2-(N-二十六烷?；被?-3,4-二-O-苯甲?；?植物鞘氨醇為起始原料，首先在NIS/TMSOTf的作用下通過糖基化反應(yīng)得到偶聯(lián)產(chǎn)物3，進而堿性條件脫除苯甲酰基，氫化脫除芐基，總共3步即可獲得KRN7000，總收率高達57.3%。KRN7000的合成路線見圖1。

圖1 KRN7000的合成路線

1.2.2化合物3的制備

將糖基供體1(1.31 g，2.25 mmol，1.5 eq)、受體2(1.35 g，1.5 mmol)和N-碘代丁二酰亞胺 (675 mg，4.5 mmol，2 eq)溶于干燥的二氯甲烷(5 mL)中，加入0.4 nm分子篩。在0 ℃下攪拌10 min，快速加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯(TMSOTf，27 μL，0.15 mmol，0.1 eq)，反應(yīng)液持續(xù)在0 ℃攪拌2 h。加入三乙胺中和反應(yīng)體系，加入飽和Na2S2O3溶液，反應(yīng)用二氯甲烷萃取3次，減壓濃縮，所得濃縮物用柱色譜分離，得到化合物3(構(gòu)型為α)，為無色液體(1.31 g，61%)。糖基化總收率為81%(α/β=3/1)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=8.03(d，J=7.2 Hz，2H)，7.92(d，J=7.2 Hz，2H)，7.59(t，J=7.2 Hz，1H)，7.51(t，J=7.2 Hz，1H)，7.45(t，J=7.2 Hz，2H)，7.38～7.29(m，10H)，7.27～7.17(m，12H)，7.03(d，J=9.2 Hz，1H)，5.70(dd，J=2.0，9.6 Hz，1H)，5.42～5.38(m，1H)，4.87(d，J=11.6 Hz，1H)，4.75～4.72(m，2H)，4.67～4.65(m，3H)，4.56～4.50(m，3H)，4.41(d，J=11.6 Hz，1H)，4.07(t，J=5.6 Hz，1H)，3.98(dd，J=2.0，10.4 Hz，1H)，3.94(dd，J=2.4，12.0 Hz，1H)，3.87～3.82(m，2H)，3.61(d，J=10.0 Hz，1H)，3.50(t，J=10.4 Hz，1H)，3.22(dd，J=5.6，9.2 Hz，1H)，2.16(t，J=7.6 Hz，2H)，1.91～1.87(m，2H)，1.64～1.60(m，2H)，1.26～1.20(m，68H)，0.88(t，J=6.0 Hz，6H)ppm；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ=173.1，166.1，165.3,138.8，138.4，138.3，137.8，133.2，132.8，130.2，130.0，129.8，128.5，128.3，128.2，128.1，128.0，127.9，127.7，127.6，127.5，127.4，127.3，100.1，78.7，75.0，74.7，73.9，73.5，73.2，72.8，72.3，70.3，70.0，69.1，48.6，36.7，31.9，29.7，29.6，29.5，29.4，29.3，28.4，25.7，22.7，14.1 ppm。

1.2.3化合物4的制備

將化合物3(830 mg，0.58 mmol) 溶于5 mL無水甲醇中，加入1 mol/L甲醇鈉的甲醇溶液，調(diào)節(jié)pH值到9～10，然后在室溫下攪拌3 h直到反應(yīng)結(jié)束。加入酸性樹脂IR-120中和，并加入過量的二氯甲烷使產(chǎn)物完全溶解，過濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑，所得濃縮物用快速柱色譜分離，得到化合物4為無色液體(660 mg，94%)。1H NMR(400 MHz，CD3OD/CDCl3=5/1)∶δ=7.39～7.26(m，20H)，6.40(d，J=8.4 Hz，1H)，4.94～4.85(m，3H)，4.80～4.73 (m，2H)，4.68(d，J=11.6 Hz，1H)，4.57(d，J=11.6 Hz，1H)，4.48(d，J=11.6 Hz，1H)，4.39(d，J=11.6 Hz，1H)，4.22(dd，J=3.6，8.0 Hz，1H)，4.05(dd，J=3.6，9.6 Hz，1H)，3.97(s，1H)，3.89～3.85(m，4H)，3.80(d，J=8.0 Hz，1H)，3.53～3.48(m，4H)，2.36(d，J=4.4 Hz，1H)，2.13(t，J=7.6 Hz，2H)，1.60～1.57(m，3H)，1.49～1.42(m，1H)，1.31～1.26(m，68H)，0.89(t，J=6.8 Hz，6H)ppm；13C NMR(100 MHz，CD3OD/CDCl3=5/1)δ=173.2，138.5，138.4，137.9，137.6，128.5，128.4，128.3，128.2，128.1，128.0，127.9，127.7，127.6，127.5，99.2，79.3，76.2，76.1，74.8，74.5，74.2，73.6，73.3，72.8，70.0，69.9，69.0，49.6，36.8，33.3，31.9，29.7，29.6，29.4，29.3，25.9，25.7，22.7，14.1 ppm。

1.2.4KRN7000的制備

2 結(jié)果與討論

2.1 糖基化反應(yīng)

此路線的關(guān)鍵步驟是糖基供體1和受體2之間的糖基化反應(yīng)，我們對此步進行優(yōu)化，首先在25 ℃進行反應(yīng)的嘗試，實驗結(jié)果顯示只有痕量的產(chǎn)物3生成。因此降溫至0 ℃，收率能達到21%。由于半乳糖部分原料相對于植物鞘氨醇部分價格便宜得多，因此定化合物2為1個當(dāng)量，通過增加化合物1、NIS及TMSOTf的當(dāng)量，發(fā)現(xiàn)收率有所提高(入口2～5)。最后確定最佳糖基化條件為n(2)∶n(1)∶n(NIS)∶n(TMSOTf)=1∶1.5∶2∶0.1，溫度0 ℃。

表1 投料比及溫度對糖基化反應(yīng)的影響

2.2 脫保護反應(yīng)

最后一步脫除芐基的反應(yīng)，我們嘗試了幾種溶劑，最終確定在二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中能定量反應(yīng)，只需要過濾出氫氧化鈀/碳，蒸干即得高純度的目標(biāo)化合物KNR7000。

表2 溶劑對脫芐基反應(yīng)的影響

3 結(jié)論

本文開發(fā)了一條以2,3,4,6-四-氧-芐基-α-D-半乳吡喃糖硫苷和苯甲?；Ｗo的植物鞘氨醇為起始原料，依次通過酸催化的糖苷化反應(yīng)、堿性條件脫除苯甲酰基和氫氧化鈀/碳通入氫氣脫除芐基得到藥物分子KRN7000。其中硫苷作為穩(wěn)定易得的糖苷供體，使得糖苷化反應(yīng)變得溫和、易于操作。此路線總共3步，總收率達57.3%。該路線具有原料易得、操作簡單、收率高等優(yōu)點，為KRN7000類似物的合成提供了一種新的方法。