王紫娟 向建英 成曉

摘 要： 染色體數(shù)目分析是現(xiàn)代系統(tǒng)與進化植物學(xué)研究十分重要和不可缺少的環(huán)節(jié)。在蕨類植物中，使用根尖或孢子母細胞作為實驗材料的經(jīng)典方法在取樣時往往存在困難。該文以3種桫欏科桫欏屬植物為例，探尋適合蕨類植物染色體數(shù)目研究的材料。由于取樣時沒有時間、季節(jié)和數(shù)量上的限制，我們推薦配子體作為蕨類植物染色體數(shù)目研究的實驗材料。

關(guān)鍵詞： 桫欏屬， 染色體計數(shù)， 桫欏科， 配子體， 實驗材料

Abstract： Analysis of chromosome numbers is a very important and indispensable step in modern systematic and evolutionary botany research. In ferns， the classical methods using root tips or sporocytes as materials often have difficulties when sampling. In this paper， three species of Alsophila （Cyatheaceae） were taken as examples to explore the materials suitable for the study of chromosome numbers of ferns. As there are no time， season and quantitative restrictions in sampling， gametophytes were recommended as experimental materials for the study of chromosome numbers of ferns.

Key words： Alsophila， chromosome count， Cyatheaceae， gametophyte， experimental material

染色體數(shù)目分析是現(xiàn)代系統(tǒng)與進化植物學(xué)研究十分重要和不可缺少的環(huán)節(jié)。對于那些對分類、起源和進化感興趣的植物學(xué)家來說，染色體數(shù)目分析是研究任何一類植物的一個基本環(huán)節(jié)（Guerra，2008）。植物體內(nèi)的染色體數(shù)目能提供物種種內(nèi)和種間遺傳分化的信息，這有助于我們在各個分類等級上理解植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（Windham & Yatskievych，2003;Glick & Mayrose，2014）。認識到染色體數(shù)目數(shù)據(jù)對植物系統(tǒng)進化研究的重要性，研究人員已經(jīng)做了很多努力來盡可能多地確定物種和種群的染色體數(shù)目。

有花植物的染色體研究可以追溯到19世紀，而蕨類植物的染色體研究直到20世紀才開始，并且在最初的20年內(nèi)只有不到20種蕨類的染色體數(shù)目被報道過，這一方面由于蕨類植物的染色體數(shù)目普遍高，并且染色體小，用傳統(tǒng)的石蠟切片法很難進行準確的染色體計數(shù)（吳兆洪，1984;王任翔等，2007）;另一方面由于蕨類植物的根尖細胞含有堅硬的黏性物質(zhì)，采用有花植物根尖水解的方法效果不理想，很難制作壓制均勻、染色體清晰的裝片。因此，直到1950年Manton的書Problems of Cytology and Evolution in the Pteridophyta（《蕨類植物的細胞學(xué)和進化問題》）出版后，蕨類植物的染色體準確計數(shù)才得以實現(xiàn)。Manton采用孢子母細胞醋酸洋紅壓片技術(shù)來解決蕨類植物的染色體計數(shù)問題。蕨類植物的染色體研究雖然起步較晚，但發(fā)展速度卻比顯花植物快得多。在Manton的書出版之后的20年內(nèi)，有2 000多種蕨類植物的染色體數(shù)目被報道出來，占世界總蕨類植物的20%（Walker，1973）。在20世紀80年代到90年代初，蕨類植物的染色體研究達到了高峰（王任翔等，2007），此后，相關(guān)的研究論文急劇減少。一方面，可能因為分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)移了科研人員的研究興趣;另一方面，Manton采用的孢子母細胞壓片法也有一定的局限性，比如難以獲取合適的孢子母細胞。邵文（2013）建議使用胚胎或幼孢子體進行蕨類植物的染色體研究，但從孢子到胚胎和幼孢子體的形成需要較長時間，會影響研究進展。因此，有必要為蕨類植物染色體數(shù)目研究尋找一種更方便、更有效的實驗材料。

本研究以孢子來源的配子體為材料，以3種桫欏科（Cyatheaceae）桫欏屬（Alsophila）蕨類為例，探討配子體在蕨類植物染色體計數(shù)研究中的優(yōu)勢。

1 材料與方法

用于染色體計數(shù)的實驗材料是用孢子培養(yǎng)出來的配子體。孢子可以從保存好的標本上收集或從活植物體上采集。

用于本研究的蕨類為黑桫欏（A. podophylla）、大葉黑桫欏（A. gigantea）以及滇南桫欏（A. austro-yunnanensis）。2015年，在云南南部的西雙版納熱帶植物園、小臘公路以及河口至屏邊的公路旁分別收集了它們的孢子（表1），在實驗室里將其播種于腐殖土中，進行配子體培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)育成幼原葉體或心型原葉體具有良好的分生組織后（1～3周），用0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉溶液預(yù)處理3～5 h。首先用Farmers固定液（95%乙醇∶冰醋酸=3∶1）在4 ℃固定0.5 h以上，依次用95%、70%和50%酒精以及蒸餾水洗脫，然后用1 N鹽酸在60 ℃的水浴鍋中解離6～10 min，最后在1%醋酸洋紅中對配子體材料進行壓片。

配子體有絲分裂細胞經(jīng)過預(yù)處理、固定、解離、染色和壓片后，用奧林巴斯BX51顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

染色體觀察結(jié)果匯總于表1。這三種蕨類的染色體都很分散，易于觀察和計數(shù)，n=69（圖1）。

黑桫欏在中國的香港、臺灣、貴州、云南、福建、廣東、廣西以及海南都有分布，另外也分布于日本、越南、老撾、泰國以及柬埔寨等國家（張憲春，2004）。早在1965年，Roy & Holttum就對廣東鼎湖山的黑桫欏材料進行了染色體數(shù)目報道;在1989年，Nakato對分布于日本的黑桫欏進行了染色體研究，均以根尖為材料，發(fā)現(xiàn)黑桫欏為二倍體，報道其染色體數(shù)目分別為2n=c.140和2n=138。本研究中，以配子體為實驗材料，觀察到的結(jié)果與他們報道的一致，黑桫欏配子體的染色體數(shù)目為n=69（圖1： A），黑桫欏為二倍體物種。

大葉黑桫欏分布于中國的云南、廣東、廣西以及海南，在日本的南部、馬來半島、老撾等東南亞國家以及印度等南亞國家也有分布 （張憲春，2004）。早在1954年，Manton & Sledge采用孢子母細胞醋酸洋紅壓片法對分布于南亞錫蘭（現(xiàn)更名為斯里蘭卡）的大葉黑桫欏進行了染色體數(shù)目研究，發(fā)現(xiàn)n=69;在1962年，Abraham et al. 以根尖為材料，對分布于印度南部的大葉黑桫欏進行了染色體分析，得到2n=138;在1999年，Kato & Nakato同樣以根尖為實驗材料，對采自中國海南的材料進行了染色體報道，2n=138。本研究以配子體為材料，觀察到n=69（圖1： B），與他們報道的結(jié)果一致，大葉黑桫欏是一個有性二倍體物種。

滇南桫欏為中國特有種，主要分布在云南的屏邊和麻栗坡（張憲春，2004）。本研究材料采自屏邊，此次為首次對其染色體數(shù)目進行報道。我們觀察到滇南桫欏配子體的染色體數(shù)目為n=69（圖1： C），它也是一個有性二倍體種。

3 討論與結(jié)論

以孢子來源的配子體為材料，觀察到黑桫欏和大葉黑桫欏的染色體數(shù)目與以往報道的采用根尖或孢子母細胞為材料的染色體結(jié)果一致，但利用配子體為實驗材料的優(yōu)勢卻是顯而易見的。

對蕨類植物進行染色體研究時，通常采用根尖或孢子母細胞為材料，但根尖或孢子母細胞的生長活躍期非常有限，這就限制了取樣時間，取樣的困難阻礙了很多植物的細胞學(xué)研究。以孢子培養(yǎng)來源的配子體為材料，取樣時間不限，只要給予適當(dāng)?shù)娜斯l件，孢子一年四季均可培養(yǎng)，配子體取樣不受具體時間、季節(jié)影響。孢子可以從標本館標本或活植物體上收集。如果儲存得當(dāng)，蕨類植物的孢子可以存活數(shù)十年（Windham & Haufler，1986）。此外，孢子培養(yǎng)配子體的技術(shù)非常簡單，可為研究人員提供足夠多的樣本材料進行細胞學(xué)研究，特別是對于那些難以判斷根尖生長活躍狀態(tài)或難以把握孢子母細胞產(chǎn)生精確時間的沒有經(jīng)驗的人來說。通過孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的配子體在一年中任何時候都可獲得，打破了季節(jié)和時間的限制，減少了野外采樣的工作量。這種方法在處理難于獲得的蕨類植物時特別有利，例如桫欏科（Cyatheaceae）和碎米蕨類（Cheilanthoid ferns）植物。桫欏科植物是一類特殊的蕨類植物，具有樹狀根莖，1975年被列入“瀕危物種國際貿(mào)易公約”（CITES），是中國二級重點保護植物。野外直接挖取根尖會使這些物種在野外的生存受到極大的威脅。桫欏科是一個泛熱帶大科，全球分布著約500種現(xiàn)存物種（Tryon & Gastony，1975）;然而，到目前為止，被計算染色體的物種還不到40種。碎米蕨類通常分布于偏僻的地方很難成功移栽，孢子囊群小，并由毛、鱗片和反折的葉邊覆蓋，很難獲得適宜的根尖材料或孢子母細胞;在Windham & Yatskievych（2003）以孢子萌發(fā)的配子體為實驗材料進行細胞學(xué)研究之前，只有不到20%的碎米蕨類染色體被報道出來。況且，蕨類植物根尖含有難以水解的黏性物質(zhì)，同時蕨類植物的染色體小、數(shù)目多，很難獲得染色體完全分散的裝片，而蕨類植物的配子體只有一層細胞構(gòu)成，易于壓制，染色體數(shù)量是根尖細胞的一半，因而更容易被觀察和統(tǒng)計。

Manton（1950）在她的書Problems of Cytology and Evolution in the Pteridophyta（《蕨類植物的細胞學(xué)和進化問題》）中提到了這種方法，但除了Roy & Manton（1965）、Gastony & Haufler（1976）、Windham & Haufler（1986）、Windham & Yatskievych（2003）、Dong（2011）外，很少有研究者利用配子體進行蕨類植物的細胞學(xué)研究。大多研究仍然使用根尖或孢子母細胞作為蕨類細胞學(xué)研究的實驗材料（盧金梅等，2006;Hsieh et al.，2008;Wang et al.，2011;王任翔等，2013）。

基于本文介紹的3種蕨類植物所取得的積極結(jié)果，以及所提到的眾多優(yōu)點，我們強烈推薦將配子體作為蕨類植物的細胞學(xué)研究材料。采用孢子萌發(fā)的配子體為實驗材料，可以彌補根尖或孢子母細胞取樣的不足。

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（責(zé)任編輯 李 莉）