孫 娟，潘金華，張壯志，李 霞，趙 楠，梁廣津，史 良，姜黎明，曲艷艷，羅世菊，李曉捷

(山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003)

多肋藻(Costariacostata)是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大型褐藻，屬于海帶目(Laminariales)、海帶科(Laminariaceae)，是多肋藻屬(Costaria)中唯一的一個(gè)種[1]。多肋藻自然資源主要分布在北太平洋沿岸潮間帶或者潮下帶淺海區(qū)域，其中朝鮮半島東北沿海、日本北海道及本土、俄羅斯遠(yuǎn)東的鄂霍次克海、大彼得灣均有分布[2-5]。多肋藻藻體葉片具有5條縱向分布的“肋”，在日本被稱為“筋布”，富含碘和多種人體必需微量元素，具有較高營養(yǎng)價(jià)值和悠久的食用歷史[1，6]。由學(xué)策等[7]在室溫條件下跟蹤觀測了多肋藻配子體生長狀況以及孢子體育苗后幼苗生長情況，為室溫條件下多肋藻育苗提供了重要參考；Fu等[8]和梁廣津等[9]分別采用孢子體育苗和配子體育苗技術(shù)完成多肋藻育苗并進(jìn)行海區(qū)栽培試驗(yàn)，藻體長度分別達(dá)到194.0和228.3 cm。李苗苗等[10]提取了多肋藻多糖并對其理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，表明多肋藻中多糖主要為褐藻膠和2種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的褐藻糖膠，是一種多糖含量豐富的優(yōu)良藻種。李鷥鷥等[11]優(yōu)化了多肋藻巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝并對其降血脂作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示多肋藻巖藻聚糖硫酸酯粗提物對小鼠血清總膽固醇、血清甘油三酯和低密度脂蛋白均具有顯著的抑制作用。多肋藻作為一種優(yōu)良的大型經(jīng)濟(jì)褐藻，其商業(yè)化開發(fā)利用具有重要的價(jià)值和意義，開發(fā)其配子體快速擴(kuò)增培養(yǎng)技術(shù)，對采用配子體進(jìn)行多肋藻苗種繁育，提高苗種繁育效率并對多肋藻大規(guī)模產(chǎn)業(yè)栽培和開發(fā)也具有重要的支撐作用。本文以多肋藻配子體為研究對象，通過設(shè)定不同溫度和光照強(qiáng)度條件研究多肋藻配子體適宜生長條件，以期為多肋藻配子體規(guī)?；瘮U(kuò)增培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中采用的多肋藻配子體，取自國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心種質(zhì)庫。

1.2 試驗(yàn)方法

將多肋藻雌、雄配子體磨碎，分裝進(jìn)入培養(yǎng)皿內(nèi)(φ 9 cm)，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱(10℃和1 000 lx)進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)1周，然后將恢復(fù)培養(yǎng)之后裝有多肋藻配子體的培養(yǎng)皿分別轉(zhuǎn)入溫度8、12、15、20、23℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，每個(gè)溫度條件下設(shè)置500、1 000、2 000、3 000、4 000 lx共5個(gè)光照強(qiáng)度條件。雌、雄配子體分別進(jìn)行相同溫度和光照條件的試驗(yàn)。每周鏡檢配子體狀態(tài)，經(jīng)過4周培養(yǎng)之后，拍照(Olympus IX51)，并采用Image-pro進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。每個(gè)試驗(yàn)條件設(shè)3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿測量10個(gè)數(shù)據(jù)，即每個(gè)試驗(yàn)條件共測量30個(gè)數(shù)據(jù)(n=30)。根據(jù)初始配子體平均長度(L0)和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的配子體平均總長度(L1)計(jì)算相對生長速率(RGR，%·d-1)，計(jì)算公式RGR=100·[ln(L1)-ln(L0)]/t，其中t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用雙因素方差分析檢驗(yàn)溫度和光照條件對多肋藻配子體生長的影響，相同溫度條件下進(jìn)行單因素方差分析并采用LSD進(jìn)行差異顯著性分析。Leven’s-test進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，必要時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化。顯著水平設(shè)為P<0.05。所有統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 17.0軟件內(nèi)完成。

2 結(jié)果

2.1 溫度8℃條件下多肋藻雌、雄配子體生長情況

在8℃條件下，只有當(dāng)光照強(qiáng)度為500 lx時(shí)，多肋藻雌配子體才生長，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，配子體平均總長度由81.27 μm生長至214.72 μm，相對生長速率約3.05%；在所設(shè)置的其它光照強(qiáng)度下幾乎全部萎縮、衰亡，無法正常存活。而雄配子體在500 lx生長最快，配子體平均總長度由77.63 μm生長至6 022.80 μm，相對生長速率約14.42%，生長速度顯著大于其他光照組(P<0.05)(圖1和圖2)。

2.2 溫度12℃條件下多肋藻雌、雄配子體生長情況

在12℃條件下，多肋藻雌配子體在1 000 lx時(shí)生長最快，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，配子體平均總長度由81.27 μm生長至1 040.33 μm，相對生長速率約8.73%，生長速度顯著大于其他光照組(P<0.05)。而雄配子體在500 lx生長最快，配子體平均總長度由77.63 μm生長至3 387.07 μm，相對生長速率約12.97%，生長速度與1 000 lx試驗(yàn)組差異不顯著，但顯著大于其他光照組(P<0.05)(圖3和圖4)。

2.3 溫度15℃條件下多肋藻雌、雄配子體生長情況

在15℃條件下，多肋藻雌配子體在500 lx時(shí)生長最快，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，配子體平均總長度由81.27 μm生長至8 813.40 μm，相對生長速率約16.04%，生長速度顯著大于其他光照組(P<0.05)。而雄配子體在2 000 lx生長最快，配子體平均總長度由77.63 μm生長至8 322.13 μm，相對生長速率約16.10%，生長速度顯著大于其他光照組(P<0.05)(圖5和圖6)。

2.4 溫度20℃條件下多肋藻雌、雄配子體生長情況

在20℃條件下，多肋藻雌配子體在1 000 lx時(shí)生長最快，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，配子體平均總長度由81.27 μm生長至10 234.07 μm，相對生長速率約16.58%，生長速度顯著大于其他光照組(P<0.05)。而雄配子體在2 000 lx生長最快，配子體平均總長度由77.63 μm生長至17 215.33 μm，相對生長速率約18.54%，生長速度與1 000 lx試驗(yàn)組差異不顯著，但顯著大于其他光照組(P<0.05)(圖7和圖8)。

2.5 溫度23℃條件下多肋藻雌、雄配子體生長情況

在23℃條件下，多肋藻雌配子體在1 000 lx時(shí)生長最快，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，配子體平均總長度由81.27 μm生長至7 865.67 μm，相對生長速率約15.82%，生長速度顯著大于其他光照組(P<0.05)。而雄配子體在2 000 lx生長最快，配子體平均總長度由77.63 μm生長至15 206.83 μm，相對生長速率約18.20%，生長速度顯著大于其他光照組(P<0.05)(圖9和圖10)。

3 討論

20世紀(jì)70年代我國海藻遺傳學(xué)家方宗熙發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)條件下海帶雌、雄配子體均可形成無性繁殖系(又稱克隆系)并可以單獨(dú)培養(yǎng)[12]，隨后海帶配子體低溫、弱光保存培養(yǎng)技術(shù)獲得突破，直到目前其仍為大規(guī)模種質(zhì)保存的常用技術(shù)[13]，此后又先后開發(fā)了固相保存技術(shù)[14]和超低溫冷凍保存技術(shù)[15]，海帶配子體無性繁殖系逐步被廣泛用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究以及海帶雜交育種[16-17]。曾呈奎等[18]最早研究了培養(yǎng)溫度對海帶配子體生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)15℃和10℃分別是海帶配子體適宜生長和適宜發(fā)育的溫度條件，李曉捷等[19]對901海帶配子體的研究也得出相似結(jié)論，并且發(fā)現(xiàn)25℃是致死溫度。本研究結(jié)果顯示，在各試驗(yàn)溫度條件下，多肋藻雄配子體生長速度要顯著快于雌配子體，且隨著培養(yǎng)溫度升高，雄配子體的適應(yīng)生長光照強(qiáng)度也顯著高于雌配子體；多肋藻雌、雄配子體均在溫度20℃條件下生長速度最快，這與王軍等[20]對利尻海帶配子體的研究得出的結(jié)論相似。

本文研究發(fā)現(xiàn)在8℃條件下，雌配子僅在500 lx下能夠正常存活，但生長異常緩慢，而雄配子體則明顯比雌配子體生長速度更快，且所有試驗(yàn)條件下均能存活，在其他溫度條件下，相同光照強(qiáng)度條件下的雄配子體生長速度也大多快于雌配子體，證明多肋藻雄配子體抗逆性和適應(yīng)性要顯著強(qiáng)于雌配子體。在23℃條件下，多肋藻雌、雄配子體生長速度均出現(xiàn)明顯下降，且發(fā)生配子體萎縮衰亡。培養(yǎng)溫度是影響海帶配子體生理指標(biāo)的重要環(huán)境因素，高溫處理對海帶配子體存活率有顯著影響，且存在配子體性別差異和品種差異，奔牛配子體在23℃進(jìn)行不同時(shí)間的脅迫處理，結(jié)果顯示處理4 d后配子體存活率僅為40%左右[21]。宣慧等[22]研究發(fā)現(xiàn)在20℃條件下，海帶配子體的生長和各項(xiàng)生理指標(biāo)與對照組15℃相比無明顯變化，但在25℃條件下培養(yǎng)1 d后，葉綠素a含量逐漸下降；而在28℃和30℃條件下培養(yǎng)1 d后，細(xì)胞色素萎縮分解并隨后大量死亡。因此，多肋藻配子體的培養(yǎng)溫度應(yīng)該嚴(yán)格控制在23℃以下，最好能保持在20℃以內(nèi)。對于雌性配子體培養(yǎng)，光照強(qiáng)度保持在1 000 lx左右為宜；雄性配子體培養(yǎng)，光照強(qiáng)度保持在2 000 lx左右為宜。