王亞清 丁顯萍 張萍

摘 要：以品種綠優(yōu)1號、徽兩優(yōu)882、銀兩優(yōu)851共266個批次種子為研究對象，采取SSR分子標(biāo)記技術(shù)和田間種植鑒定2種測純方法，對2種方法的結(jié)果進(jìn)行差異性和相關(guān)性分析。結(jié)果表明：2種鑒定方法間差異不顯著，并具有一定的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R分別為0.424（綠優(yōu)1號）、0.387（徽兩優(yōu)882）、0.397（銀兩優(yōu)851），說明SSR分子標(biāo)記鑒定方法可用于雜交稻種子純度的快速鑒定。研究結(jié)果對于快速了解雜交水稻種子質(zhì)量狀況、保證用種安全和促進(jìn)優(yōu)質(zhì)種子提前上市具有重要意義。

關(guān)鍵詞：水稻;SSR分子標(biāo)記;正季鑒定;純度;差異分析

中圖分類號 Q789;S511文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2021）04-0082-02

種子質(zhì)量是種子企業(yè)的生命，種子純度則是水稻種子質(zhì)量的核心指標(biāo)。傳統(tǒng)的田間小區(qū)種植鑒定是國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的、目前鑒定雜交水稻種子純度應(yīng)用最廣泛的方法，也是目前公認(rèn)最準(zhǔn)確、最可靠的方法。唐海燕等[1]對192份雜交稻種子樣品的純度進(jìn)行了田間種植鑒定，并對鑒定結(jié)果進(jìn)行了分析研究。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展和雜交新品種的不斷涌現(xiàn)，種子純度鑒定進(jìn)入了基因水平，目前應(yīng)用較為廣泛的是SSR分子標(biāo)記。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、成本較低和易于操作等優(yōu)點，利用SSR技術(shù)進(jìn)行種子純度鑒定已成為一項重要的手段。吳則東等[2]概述了AFLP、ISSR、SRAP、SSR 等4種主要的分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物品種鑒定上的研究進(jìn)展，提出了SSR將是未來利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定品種純度以及品種DUS測試的首選分子標(biāo)記技術(shù)。王慧等[3]研究了不同世代恢復(fù)系所配雜交種種子室內(nèi)分子鑒定與田間種植鑒定純度結(jié)果的吻合度。結(jié)果表明：當(dāng)恢復(fù)系完全純合時，可用室內(nèi)SSR分子標(biāo)記鑒定替代田間種植鑒定來鑒定其雜交種的純度。筆者選取安徽荃銀高科種業(yè)股份有限公司3個品種3年入庫樣品共計266批次種子，探討了水稻品種的SSR標(biāo)記技術(shù)與田間正季鑒定2種純度檢測結(jié)果的相關(guān)性和差異性，以期為雜交水稻種子純度鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 F1代材料：2018—2020年入庫的種子，其中，綠優(yōu)1號235批、徽兩優(yōu)882 13批、銀兩優(yōu)851 18批，分別來自福建、貴州、四川、江西、江蘇等5個制種基地?；瘜W(xué)試劑：Tris-HCL、乙酸銨、10% SDS、EDTA、乙醇、6%聚丙烯酰胺、5×TBE、10%AP、TEMED、AgNO3、NaOH、甲醛等。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間鑒定 選擇水源充足、排灌方便、肥力中等、形狀規(guī)則、光照條件好的田塊作為鑒定田。每個批次按照國家標(biāo)準(zhǔn)鑒定400株，在種子收后次年4月中下旬播種，5月中下旬移栽，8月上中旬進(jìn)行鑒定。此鑒定時期、鑒定小區(qū)的植株基本與大田生產(chǎn)種植植株的生育期進(jìn)程處于同一時期。采用人工觀察統(tǒng)計的方法分別在抽穗揚(yáng)花期、成熟期進(jìn)行鑒定，記錄父本、母本、保持系以及其他雜株類型。

1.2.2 SSR分子標(biāo)記 DNA的提?。杭羧?～2cm長的種子幼苗，冷凍后利用球磨儀進(jìn)行研磨，采用張雯等[4]優(yōu)化后的DNA提取法分別提取綠優(yōu)1號、徽兩優(yōu)882、銀兩優(yōu)851共計266批次種子的DNA備用。引物的篩選：根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1433—2014公布的48對引物，分別對3個品種篩選出2對引物，綠優(yōu)1號：RM583和RM471;徽兩優(yōu)882：RM339和RM3331;銀兩優(yōu)851：RM471和RM481。PCR體系配比（10μL）：DNA模板1μL，上游引物0.25μL，下游引物0.25μL，Mix 5μL，ddH2O 3.5μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，進(jìn)行30次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)，10℃恒溫保存。電泳和染色：采取非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染[5]。

1.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)利用Excel進(jìn)行卡方（χ2）分析。

χ2=∑（|分子測純-正季鑒定|）2/正季鑒定

2 結(jié)果與分析

2.1 2種不同鑒定方法結(jié)果的差異性 由表1可知，銀兩優(yōu)851種子的純度最好，合格率均為94.4%;綠優(yōu)1號和徽兩優(yōu)882種子的純度合格率均是正季鑒定高于分子鑒定;3個品種的χ2計算分析，綠優(yōu)1號：χ2=27.287<χ20.05，100=124.34<χ20.05，234，P>0.05;徽兩優(yōu)882：χ2=0.414<χ20.05，12=21.03，P>0.05;銀兩優(yōu)851：χ2=10.085<χ20.05，17=27.59，P>0.05;表明3個品種種子的分子鑒定結(jié)果與正季鑒定結(jié)果差異均不顯著。由此可見，SSR分子標(biāo)記鑒定方法用于綠優(yōu)1號、徽兩優(yōu)882、銀兩優(yōu)851這3個品種種子純度鑒定均具有可靠性。

2.2 2種不同鑒定方法結(jié)果的相關(guān)性 對3個品種的正季鑒定和SSR分子測純結(jié)果分別作相關(guān)性分析。相關(guān)系數(shù)R>0表示2變量存在正的線性關(guān)系;R<0表示負(fù)的線性關(guān)系;|R|>0.8表示具有較強(qiáng)的線性相關(guān)關(guān)系;|R|<0.3表示具有較弱的線性相關(guān)關(guān)系。由圖1、2、3可知，綠優(yōu)1號、徽兩優(yōu)882和銀兩優(yōu)851的正季鑒定結(jié)果與SSR分子鑒定結(jié)果均呈正相關(guān)，其中綠優(yōu)1號的相關(guān)系數(shù)R為0.424，徽兩優(yōu)882的相關(guān)系數(shù)R為0.387，銀兩優(yōu)851的相關(guān)系數(shù)R為0.397，均說明這2種鑒定方法具有相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明：3個品種種子純度2種方法的鑒定結(jié)果均表現(xiàn)出正相關(guān)性，且R均>0.3，說明SSR分子鑒定結(jié)果與正季鑒定結(jié)果存在相關(guān)關(guān)系，這與陽慶華等[6]研究結(jié)果一致。SSR分子鑒定結(jié)果與正季鑒定結(jié)果雖然存在差異，但差異并不顯著。主要原因在于其他品種串粉田間雜株多，其籽粒性狀和植株生育期都與真品種較為接近，難以分辨;另外，田間環(huán)境和人為因素可能會造成影響。這表明了分子標(biāo)記更易區(qū)分真雜種子，而田間正季鑒定難以區(qū)分相似的雜株。因此SSR分子標(biāo)記鑒定方法可用于雜交稻品種純度的快速鑒定，這與陳年偉等[7]研究結(jié)果一致。

參考文獻(xiàn)

[1]唐海燕，嚴(yán)欽泉，嚴(yán)秋平.雜交水稻種子純度田間種植鑒定的結(jié)果與分析[J].雜交水稻，2005（3）：38-42.

[2]吳則東，江偉，馬龍彪.分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物品種鑒定上的研究進(jìn)展及未來展望[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2015，31（33）：172-176.

[3]王慧，張從合，陳金節(jié)，等.基于NY/T 1433—2014推薦SSR標(biāo)記檢測不同世代恢復(fù)系配制雜交種的純度研究[J].雜交水稻，2019，34（2）：59-62.

[4]張雯，丁顯萍，張萍，等.雜交水稻種子純度DNA指紋鑒定與田間鑒定結(jié)果的比較[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2018，24（13）：11-12.

[5]任輝.SSR分子標(biāo)記在雜交水稻品種純度鑒定中的應(yīng)用研究[D].杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2013.

[6]陽慶華，李秀瓊，魯孟海.SSR分子檢測與田間小區(qū)種植鑒定揚(yáng)兩優(yōu)6號純度的比較[J].中國種業(yè)，2014（7）：49-50.

[7]陳年偉，張體剛，徐昌能，等.SSR分子檢測與田間種植鑒定雜交稻種子純度的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，22（3）：553-555.

（責(zé)編：徐世紅）