董旭，韓學(xué)昌，邢群智，任巖巖，張亞杰

（河南科技大學(xué)臨床學(xué)院 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽(yáng)471003）

七氟醚是一種氣味芬芳的新型吸入麻醉劑,對(duì)人體氣道造成的刺激較小,具有麻醉誘導(dǎo)和蘇醒迅速、對(duì)呼吸系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)影響較小等諸多優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已在臨床上廣泛應(yīng)用于小兒麻醉[1]。臨床上需要多次手術(shù)的患兒逐漸增加,而七氟醚是目前臨床上應(yīng)用于小兒麻醉的首選藥物之一[2]。有研究報(bào)道,七氟醚可導(dǎo)致接受過(guò)七氟醚麻醉的兒童出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶的障礙[3]。本文通過(guò)研究重復(fù)吸入七氟醚大鼠并于正常大鼠進(jìn)行比較,探究七氟醚對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,為臨床上患兒重復(fù)吸入七氟醚進(jìn)行麻醉的安全性以及可靠性提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取由河南科技大學(xué)提供的新生SD大鼠48只,均為雄性,SPF級(jí)(大鼠合格證編號(hào):SYXK(豫)2018-0015),日齡7d,喂養(yǎng)于光照12h、室內(nèi)溫度23℃～25℃、相對(duì)濕度45%～60%、自由進(jìn)食進(jìn)水的環(huán)境中。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器、藥品 七氟醚購(gòu)自山東魯南貝特制藥有限公司(批號(hào)65130702),Anti-Tau antibody購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(批號(hào):ab32057),Anti-Tau(phosphor Ser396)antibody購(gòu)自英國(guó)Abcam公司

(批號(hào):ab109390),病理切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司,顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司,七氟醚揮發(fā)罐、S/5多功能麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Datex.Ohmeda公司,WMT-100型Morris水迷宮測(cè)試儀購(gòu)自成都泰盟多功科技有限公司,BDNF抗體購(gòu)自英國(guó)Santa公司,PSD95抗體購(gòu)自英國(guó)Bioss公司,Tau抗體購(gòu)于英國(guó)Bioss公司,熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Li-COR公司,ApoE ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)MyBioSource公司。

1.2.2 干預(yù)方法 將實(shí)驗(yàn)組大鼠置于麻醉誘導(dǎo)箱中,通過(guò)調(diào)節(jié)七氟醚揮發(fā)罐和S/5多功能麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀中設(shè)置七氟醚濃度,流量為2L/min,持續(xù)3h,對(duì)照組不做任何處理,術(shù)中使用電加熱板維持體溫36.5～37.5℃麻醉過(guò)程中觀時(shí)刻察大鼠的皮膚顏色,防止出現(xiàn)呼吸抑制。

1.2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)程序：⑴定位航行實(shí)驗(yàn)一般被用來(lái)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶的能力。此實(shí)驗(yàn)總共耗時(shí)6 d,這6d中總共對(duì)小鼠進(jìn)行5次訓(xùn)練。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過(guò)程中一直保持水溫穩(wěn)定在25℃左右,訓(xùn)練時(shí),大鼠分別在四個(gè)象限1/2弧度處頭朝池壁入水。由計(jì)算機(jī)記錄大鼠從入水點(diǎn)入水到到達(dá)平臺(tái)所消耗的總時(shí)間,如果大鼠在60s內(nèi)未能到達(dá)平臺(tái),則計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)時(shí)60s,再由實(shí)驗(yàn)人員負(fù)責(zé)引導(dǎo)大鼠,使其按直線游至平臺(tái),并且訓(xùn)練大鼠在平臺(tái)上站立10 s,促進(jìn)大鼠對(duì)平臺(tái)的位置進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶。此外,實(shí)驗(yàn)中還需觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間和距離,即記錄其潛伏期和游泳距離。⑵空間搜索實(shí)驗(yàn)被用來(lái)測(cè)試大鼠對(duì)水池平臺(tái)位置記憶的持續(xù)能力。在定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練結(jié)束后,撤去水池中的平臺(tái),將大鼠置于水中,觀察并記錄大鼠第一次到達(dá)水池平臺(tái)位置的時(shí)間以及在原平臺(tái)所在象限中停留的時(shí)間。數(shù)據(jù)的采集以及處理都是由MWM自帶的圖像系統(tǒng)完成。

1.2.4 Wesern-blot法 采用Wesern-blot法對(duì)BDNFβ-actin、PSD-95以及Tau進(jìn)行測(cè)定。在水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,使大鼠吸入5%七氟醚將其麻醉,再將大鼠處死并取其大腦中的海馬區(qū)組織,再用裂解液提取總蛋白,測(cè)定其濃度,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法使目的蛋白分離,之后進(jìn)行冰浴轉(zhuǎn)膜,再在室溫下用脫脂奶粉封閉1～2。封閉結(jié)束之后,依次加入BDNF抗體,PSD95抗體以及Tau抗體,4℃條件下孵育過(guò)夜,次日用二抗孵育1h后TBST洗膜三次,每次10min,最后用紅外成像系統(tǒng)掃膜并采用Odessay軟件測(cè)定灰度值,GAPDH為內(nèi)參,用目的條帶的灰度值與GAPDH條帶的灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5 ELISA法 采集腦脊液后將其置于-80℃冰箱中冷凍保存。采用ELISA法檢測(cè)ApoE濃度。選取生物素化的抗大鼠ApoE抗體為一抗,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗體為二抗。操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。最后采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)光密度值(OD值),根據(jù)OD值繪制ApoE的質(zhì)量濃度曲線,根據(jù)ApoE的質(zhì)量濃度曲線計(jì)算ApoE濃度。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠的Morris迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)比 在出生后37d測(cè)定,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中游泳路程、原平臺(tái)象限游泳距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,實(shí)驗(yàn)組大鼠的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期、原平臺(tái)象限滯留時(shí)間均較對(duì)照組長(zhǎng)（P<0.05）；見(jiàn)表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠的海馬組織中BD-NF、PSD-95、Tau蛋白表達(dá)情況比較 在出生后37d測(cè)定,實(shí)驗(yàn)組大鼠的海馬組織中BDNF、PSD-95蛋白表達(dá)低于對(duì)照組（P<0.05）,Tau蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照組（P<0.05）；見(jiàn)表2、圖1。

表1 實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠的Morris迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)比（±s）

表1 實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠的Morris迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)比（±s）

組別n 游泳路程（mm）逃避潛伏期(s)實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組t值P值24 24 9876.9±2201.3 10092.7±2568.4-0.315 0.754原平臺(tái)象限滯留時(shí)間(s)31.05±3.26 29.11±3.31 2.066 0.044 27.84±4.49 25.20±5.13 2.022 0.049原平臺(tái)象限游泳距離（mm）7430.2±1982.3 7550.7±1846.5-0.220 0.827

表2 實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠的海馬組織中BDNF、PSD-95、Tau蛋白表達(dá)情況比較（±s,相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度）

表2 實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠的海馬組織中BDNF、PSD-95、Tau蛋白表達(dá)情況比較（±s,相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度）

組別 n實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組t值P值24 24 BDNFβ-actin PSD-95 0.961±0.271 1.309±0.332-4.010 0.000 0.733±0.154 0.941±0.187-4.240 0.000 Tau蛋白1.410±0.081 0.587±0.074 3.296 0.002

圖1 海馬組織中BDNF、PSD-95、Tau蛋白電泳圖

2.3 實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠的腦脊液中ApoE水平比較 在出生后37d測(cè)定,實(shí)驗(yàn)組大鼠腦脊液中ApoE水平高于對(duì)照組（P<0.05）；見(jiàn)表3、圖2。

表3 實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠的腦脊液中ApoE水平比較（±s）

表3 實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠的腦脊液中ApoE水平比較（±s）

組別 n實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組P值24 24 ApoE（ng/ml） t值35.82±4.16 33.09±3.73 2.394 0.021

圖2 實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠的腦脊液中ApoE水平柱狀圖

3 討論

水迷宮實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)之一,主要由定位巡航實(shí)驗(yàn)以及空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分組成[4]。其結(jié)果的重復(fù)性以及穩(wěn)定性良好,逃避潛伏期能反映大鼠的學(xué)習(xí)能力,逃避潛伏期的長(zhǎng)短與動(dòng)物的陳述性記憶能力呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系,逃避潛伏期越長(zhǎng),則陳述性記憶能力越差,反之,逃避潛伏期越短,則陳述性記憶能力越好,而在原平臺(tái)所在象限滯留的時(shí)間能則反映大鼠的空間記憶能力[5]。本次的研究結(jié)果表明,大鼠在反復(fù)接受七氟醚的麻醉之后,實(shí)驗(yàn)組的逃避潛伏期以及在原平臺(tái)滯留的時(shí)間與對(duì)照組相比都由明顯的延長(zhǎng)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這就表明大鼠在接受七氟醚的麻醉之后記憶能力下降了,提示長(zhǎng)時(shí)間的七氟醚麻醉可能會(huì)導(dǎo)致大鼠的認(rèn)知能力出現(xiàn)障礙。其他的研究也發(fā)現(xiàn),大鼠的認(rèn)知能力的障礙與七氟醚麻醉的時(shí)間呈正相關(guān)的關(guān)系,麻醉的時(shí)間越長(zhǎng),大鼠的認(rèn)知能力受損也就越嚴(yán)重。

BDNF是成熟的神經(jīng)元維持生存以及正常的生理功能所必需的,在大腦皮層以海馬組織中分布較為集中,有促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育、促進(jìn)受損神經(jīng)元恢復(fù)的功能,參與突觸的可塑性,維持了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)與記憶能力[6]。PSD-95主要分布在突觸后致密區(qū),能調(diào)節(jié)谷氨酸受體的功能,,影響突觸后可塑性。此次的研究結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組大鼠的BDNF以及PSD-95的表達(dá)強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組的大鼠且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,大鼠的BDNF以及PSD-95的表達(dá)都出現(xiàn)了下調(diào),表明海馬神經(jīng)元突觸傳遞變?nèi)?突觸的可塑性受到抑制,提示七氟醚麻醉大鼠導(dǎo)致大鼠的認(rèn)知能力受損可能與抑制海馬體組織中神經(jīng)元的突觸可塑性有關(guān)。

Tau蛋白是在神經(jīng)元中與微管有關(guān)的含量最高的蛋白,主要存在于神經(jīng)元的軸突內(nèi),能促進(jìn)微管的組裝并保持其穩(wěn)定性[7]。大量的實(shí)驗(yàn)研究提示,Tau蛋白的異常磷酸化與記憶認(rèn)知能力退化有密不可分的關(guān)系。。在正常成熟的腦內(nèi)平均僅僅只有幾個(gè)生理性磷酸化位點(diǎn),但在某些病理狀態(tài)下,Tau蛋白異常的磷酸化位點(diǎn)遠(yuǎn)高于正常水平,報(bào)道的某些病理性磷酸化位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到40個(gè)左右[8,9]。此外,Tau通過(guò)調(diào)節(jié)脯氨酸依賴性蛋白激酶來(lái)調(diào)節(jié)Tau蛋白的磷酸化的水平,這在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí)[10]。異常的過(guò)度磷酸化的Tau蛋白以配對(duì)螺旋絲的形式構(gòu)成了神經(jīng)原纖維纏結(jié)并且在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)積聚[11]。這些在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)積聚的纏結(jié)影響了神經(jīng)元的正常功能,最終會(huì)致使神經(jīng)細(xì)胞變性甚至是死亡[12]。此次研究中,實(shí)驗(yàn)組大鼠的Tau的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這也提示我們,大鼠在吸入七氟醚麻醉之后,可能會(huì)導(dǎo)致Tau的過(guò)度表達(dá)而導(dǎo)致大鼠的認(rèn)知能力受損。

ApoE是一種血漿蛋白,其主要的合成器官為肝臟,但是也可在大腦中表達(dá),其主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中合成[13]。ApoE與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和受損后的修復(fù)等過(guò)程有密切的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn),腦內(nèi)的ApoE過(guò)度表達(dá)可能與老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)形成有關(guān),一種可能的機(jī)制為ApoE加劇了β-淀粉樣肽的沉積,從而引起神經(jīng)元受損和行為異常[14-16]。在此次研究當(dāng)中,實(shí)驗(yàn)組大鼠腦脊液中的ApoE顯著高于對(duì)照組大鼠,這也提示我們實(shí)驗(yàn)組大鼠在吸入七氟醚之后可能出現(xiàn)了β-淀粉樣肽的沉積,從而導(dǎo)致大鼠的認(rèn)知能力受損。

綜上所述,大鼠在吸入七氟醚之后認(rèn)知能力與正常組大鼠相比出現(xiàn)了一定的障礙,而且Tau與ApoE的表達(dá)顯著升高,BDNF與PSD-95的表達(dá)顯著降低,表明新生期大鼠吸入七氟烷對(duì)其神經(jīng)及認(rèn)知功能發(fā)育在早期有一定的影響。