黃夢(mèng)穎，陳建輝，邱玉鋒，李曲文，徐海濱，楊勁松

（福建省疾病預(yù)防控制中心 福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350001）

沙門菌是全球重要的食源性腸道致病菌之一，其感染譜廣泛，能在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物之間傳播。人類感染沙門菌后可處于持續(xù)無癥狀攜帶狀態(tài)、短暫輕度腸胃炎狀態(tài)和嚴(yán)重的全身性感染狀態(tài)[1,2]。其中,無癥狀攜帶者可持續(xù)由糞便排出沙門菌長達(dá)一年及以上,也是重要的傳染源[3]。沙門菌毒力島[4-6]（Salmonella Pathogenicity islands,SPI）是毒力基因在沙門菌的染色體或質(zhì)粒上成簇分布的特定區(qū)域。SPI可以通過接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等方式在沙門菌之間,甚至是跨種屬細(xì)菌之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer,HGT）。SPI與沙門菌的致病性密切相關(guān)。本文通過對(duì)福建省沙門菌腹瀉患者與健康人群分離株中毒力小島pagCmsgA分布特征的研究,進(jìn)一步探索本省沙門菌的毒力特點(diǎn)，為有效防控本省沙門菌爆發(fā)提供科學(xué)可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株來源 166株沙門菌是福建省其它感染性腹瀉監(jiān)測(cè)與省屬食品從業(yè)人員健康體檢中分離留存的：其中腹瀉患者分離株121株、健康人群分離株45株。

1.2 主要試劑與儀器 常用培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂等（北京路橋）；PCR反應(yīng)試劑、DL2000 Marker（Takara）；瓊脂糖、溴化乙錠(10 mg/ml)等（上海生工）。Veriti Dx擴(kuò)增儀（美國AB）；Basic電泳儀；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）。

1.3 PCR檢測(cè)

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 引物序列及擴(kuò)增片段長度來自參考文獻(xiàn)[7]，合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3.2 DNA模板制備 采用煮沸法提取實(shí)驗(yàn)菌株DNA。從普通營養(yǎng)瓊脂平板上刮取適量純菌落于300μL純水中制成菌懸液。沸水浴10min,冰浴10 min,12000r/min離心10min,吸取上清作為PCR模板。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 PCR反應(yīng)體系及條件 反應(yīng)體系（20μl）：premix 10μl，上、下游引物（100μM）各0.3μl，DNA模板2.0μl,加純水至20μl。反應(yīng)條件：(95℃5min)+30×(95℃30s+55℃30s+72℃30s)+(72℃5 min)。

1.4.4 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè) 取5ul PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與分析。組間比較采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌腹瀉患者與健康人群分離株中毒力基因pagC與msgA的攜帶情況分析 166株沙門菌分離株中毒力基因pagC與msgA的總檢出率分別為40.96%(68/166)和56.02%(93/166)。這兩個(gè)毒力基因在沙門菌腹瀉患者分離株與健康人群分離株中的攜帶情況相似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2pagC=0.089,P=0.766；χ2msgA=1.915,P=0.166)。在兩個(gè)組別中,毒力基因pagC的攜帶率分別為39.67%（48/121）和42.22%（19/45）；毒力基因msgA的攜帶率分別為58.68%（71/121）和46.67%（21/45）。見圖1和表2。

圖1 沙門菌腹瀉患者與健康人群分離株中毒力基因pagC與msgA PCR檢測(cè)圖

表2 沙門菌腹瀉患者與健康人群分離株中毒力基因pagC與msgA的攜帶情況

2.2 沙門菌腹瀉患者與健康人群分離株中毒力基因攜帶模式情況分析 166株沙門菌分離株中，毒力基因pagC與msgA的攜帶模式分為4種：VP1：pagC+msgA-（4.85%）、VP2：pagC-msgA+（20.00%）、VP3：pagC+msgA+（36.36%）及VP4：pagC-msgA-（38.79%）。在沙門菌腹瀉患者與健康人群分離株中，毒力基因pagC與msgA的攜帶模式基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2VP1=1.255,P=0.263；χ2VP2=1.519,P=0.218；χ2VP3=0.134，P=0.714；χ2VP4=0.488,P=0.485)。最常見的攜帶模式是VP3：pagC+msgA+及VP4：pagC-msgA-,在兩個(gè)組別中的占比分別為37.19%、37.19%和34.09%、43.18%。見表3。

3 討論

革蘭陰性菌外膜的主要成分是外膜蛋白,其占比約為50%[8]。外膜蛋白不僅維持細(xì)菌正常形態(tài)、參與細(xì)菌物質(zhì)代謝，而且在細(xì)菌的耐藥及致病過程中也發(fā)揮著重要作用[8,9]。沙門菌毒力基因pagC[10-17]是由水平轉(zhuǎn)移獲得的,其編碼一種外膜蛋白。該蛋白由185個(gè)氨基酸組成,與Ail、OmpX、Rck、Lom等蛋白具有高度同源性,屬于同一個(gè)外膜蛋白家族。在低Mg2+的環(huán)境中，PagC蛋白受PhoP-PhoQ雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)。目前已知PagC在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存及全身感染過程中起一定作用。沙門菌毒力基因msgA[10,18]編碼的蛋白上沒有信號(hào)序列，是一種非包膜蛋白的小蛋白。msgA與pagC具有相似的毒力表現(xiàn)型,其也是巨噬細(xì)胞內(nèi)生存及小鼠毒力所必需的。但是，二者在調(diào)節(jié)及種系遺傳分布方面并不相同：msgA與志賀菌中一些隱蔽性質(zhì)粒上的DNA區(qū)域具有同源性；msgA的表達(dá)不受pho蛋白調(diào)節(jié)；msgA雜交序列可在缺乏pagC基因的腸道細(xì)菌中檢測(cè)到。本文就選取了這兩個(gè)染色體上位置相近、功能相似的毒力基因組成的毒力小島進(jìn)行研究。

表3 沙門菌腹瀉患者與健康人群分離株中毒力基因攜帶模式分布情況

本研究中發(fā)現(xiàn),福建省沙門菌中均檢出一定比例的毒力基因msgA與pagC，檢出率分別為40.36%和55.42%。但是，腹瀉患者分離株和健康人群分離株中這兩個(gè)毒力基因的分布情況相似，不存在顯著差異（χ2pagC=0.089，P=0.766；χ2msgA=1.915，P=0.166）。雖然我省沙門菌中這兩個(gè)毒力基因的檢出率要低于其他國家或地區(qū),但是它們?cè)诟篂a患者和健康人群分離株中的分布情況與之前報(bào)道的對(duì)鳥類和火雞中分離株的研究結(jié)果是一致的[19-23]。有趣的是Migma Dorji Tamang對(duì)豬中分離株的研究發(fā)現(xiàn)，毒力基因msgA與pagC在病豬中的攜帶率高于健康豬，特別是pagC基因的攜帶率病豬中是明顯高于健康豬[24]。這與我們的研究結(jié)果不一致。這可能是由于毒力基因msgA與pagC在不同宿主體內(nèi)的作用機(jī)制存在一定差異。具體情況需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來探索。

福建省沙門菌含有4種毒力基因攜帶模式。在沙門菌腹瀉患者與健康人群分離株中,毒力基因pagC與msgA的攜帶模式基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2VP1=1.255,P=0.263；χ2VP2=1.519,P=0.218；χ2VP3=0.134，P=0.714；χ2VP4=0.488，P=0.485）。有報(bào)道稱，msgA雜交序列可在缺乏pagC基因的腸道細(xì)菌中檢測(cè)到[18]。而且，在遺傳和水平轉(zhuǎn)移過程中可能由于某些原因基因發(fā)生丟失。所以，無論是從整體來看，還是分組別來看，VP1：pagC+msgA-占比較低，而且要明顯低于VP2：pagC-msgA+。VP3：pagC+msgA+及VP4：pagC-msgA-為最常見的基因攜帶模式。VP4：pagC-msgA-模式的存在說明在沙門菌中可能存在其他的作用機(jī)制來完成巨噬細(xì)胞內(nèi)生存及全身性感染，例如毒力基因spiA[25]。

綜上所述,福建省沙門菌pagC-msgA毒力小島在腹瀉患者與健康人群分離株中的分布情況相似,不存在差異性。本省沙門菌健康人群分離株也具有一定的致病性，和腹瀉患者分離株一樣，感染人后有可能會(huì)引發(fā)一系列的癥狀。所以，對(duì)從業(yè)人員需要加強(qiáng)食品安全相關(guān)知識(shí)培訓(xùn),提高其食品安全意識(shí)。同時(shí)，相關(guān)部門需要強(qiáng)化飲食安全的監(jiān)督和管理工作，規(guī)范從業(yè)人員行為。從而避免從業(yè)人員成為傳染源，防止發(fā)生沙門氏菌感染爆發(fā)。