張茹萍 何秀英# 凌益平 趙志良 李永盛

1 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

清解抗感合劑是本院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，來源于預(yù)防新型冠狀病毒肺炎、流感肺炎的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由三葉青、荊芥、前胡、甘草等6味中藥組成，具有疏風(fēng)解毒、潤肺止咳的功效。適用于素體肺衛(wèi)氣虛，易感風(fēng)邪，有感冒、時(shí)行感冒易感史，或鼻咽不適，或微咳，舌紅、苔薄白者。方中前胡具有降氣化痰之功效，其主要化學(xué)成分為白花前胡甲素、白花前胡乙素等角型吡喃香豆素類成分，多用于治療風(fēng)熱咳嗽痰多氣喘的氣管及支氣管炎。為制定清解抗感合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制制劑質(zhì)量，本研究采用TLC及HPLC對(duì)合劑進(jìn)行研究，建立了穩(wěn)定、可靠的定性和定量方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器：高效液相色譜儀（Agilent 1260，編號(hào)：DEAE203288），配有四元泵、DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱；YMC-pack ODS-A色譜柱（250mm×4.6mm,5μm）；分析天平：BP211D型分析天平（十萬分之一，Sartorius）；BS210S型分析天平（萬分之一，Sartorius）；JM-B20002電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI）；ZF-90型暗箱式紫外透射儀（上海顧村電光儀器廠）。

1.2 試劑與藥材：硅膠H、G、GF254薄層板（青島海洋化工有限公司），高效硅膠G薄層板（HSG,煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司）；定量毛細(xì)管（1μl，批號(hào)：889892），定量毛細(xì)管（2μl，批號(hào)：894179）均為HIRSCHMΛNN；白花前胡甲素（批號(hào)：111711-201904，純度99.4%），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904-201620），均購自中國食品藥品檢定研究院；三葉青（批號(hào)：190830），荊芥（批號(hào)：191210），前胡（批號(hào)：190918），麥冬（批號(hào)：190910），太子參（批號(hào)：191211），甘草（批號(hào)：200101），均由浙江桐君堂中藥飲片有限公司提供。清解抗感合劑：200310、200316-2、200316-3、200408、200526、200702由本院制劑室自制。HPLC流動(dòng)相中甲醇為色譜純，購自Merck公司；純水：娃哈哈純凈水；其余有機(jī)試劑為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 前胡的薄層色譜鑒別研究：分述如下。

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備：取白花前胡甲素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備：參考《中國藥典》2015年版一部[1]556“小兒清肺化痰口服液”項(xiàng)下“前胡”的鑒別。取本品30ml，用二氯甲烷振搖提取2次，每次30ml，合并二氯甲烷液，濃縮至干，殘?jiān)蛹状?ml溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液制備：按工藝方法制備缺少前胡藥材的陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 檢測(cè)方法及結(jié)果：吸取白花前胡甲素對(duì)照品溶液3μl、供試品溶液6μl及陰性對(duì)照溶液6μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以石油醚（60～90℃）-二氯甲烷-乙酸乙酯（4∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照在供試品和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上均無相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 前胡的薄層色譜圖

2.2 甘草的薄層色譜鑒別研究：分述如下。

2.2.1 供試品溶液的制備：參考《中國藥典》2015年版一部[1]478“九味羌活丸”項(xiàng)下“甘草”的鑒別。取本品30ml，加水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30ml，合并正丁醇層，加氨試液30ml洗滌，分取正丁醇層，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状?ml溶解，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液的制備：參考《中國藥典》2015年版一部[1]86“甘草”項(xiàng)下的鑒別。取甘草對(duì)照藥材1g，加甲醇加熱回流1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取兩次，每次30ml，合并正丁醇層，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状?ml溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備：按工藝方法制備缺少甘草藥材的陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 檢測(cè)方法及結(jié)果：吸取對(duì)照藥材溶液2μl、供試品溶液6μl及陰性對(duì)照溶液6μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈365nm下檢視。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照在供試品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上無相同顏色的斑點(diǎn)。見圖2。

圖2 甘草的薄層色譜圖

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件：流動(dòng)相：甲醇-水（65∶35）；色譜柱：YMCPack ODS-A（250mm×4.6mm,5μm）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：321nm；進(jìn)樣量：10μl。

3.2 供試品溶液的制備：精密量取本品5ml，置10ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，6000r/min離心15min，取上清液作為供試品溶液。

3.3 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取白花前胡甲素對(duì)照品適量，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置10ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（106.66μg/ml）。

3.4 缺前胡的陰性供試品溶液的制備：按工藝方法制備缺少前胡藥材的陰性樣品，按“3.2”項(xiàng)下方法制備成缺前胡的陰性樣品溶液。

3.5 專屬性試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μl，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。由圖3可知，陰性樣品在主峰位置沒有干擾，白花前胡甲素峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度大于1.5。

圖 3 HPLC色譜圖

3.6 系統(tǒng)適用性：精密量取對(duì)照品溶液2ml，置10ml取量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果白花前胡甲素的理論塔板數(shù)為19420，峰面積的RSD=0.22%。

3.7 線性關(guān)系：精密量取對(duì)照品溶液（106.66μg/ml）0.5ml、1ml、2ml、3ml、5ml置10ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，記錄主峰面積。計(jì)算得回歸方程y=15.293x-5.8846，相 關(guān) 系 數(shù) r=0.9999。表 明 其 在 5.333～53.33μg/ml線性關(guān)系良好。

3.8 儀器精密度試驗(yàn)：由不同人員制備樣品，在不同的液相，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，所得12份的含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.39%，表明儀器精密度試驗(yàn)良好。

3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)的樣品溶液，分別于0，1，2，4，8，12，24小時(shí)照“3.1”項(xiàng)下的方法測(cè)定，計(jì)算得RSD=0.57%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)非常穩(wěn)定。

3.10 重復(fù)性試驗(yàn)：取本品5ml，平行6份，按“3.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，所得6份樣品中白花前胡甲素含量的平均值為29.80μg/ml，RSD為1.59%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

3.11 加樣回收率試驗(yàn)：精密量取本品2.5ml，平行9份，分別加入不同量的對(duì)照品溶液，加水至5ml，置于10ml取量瓶中，再加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，離心15分鐘（每分鐘6000轉(zhuǎn)），取上清液照“3.1”項(xiàng)下的方法測(cè)定，結(jié)果見表1。各濃度下的平均回收率為101.56%，RSD=2.27%。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3.12 耐用性試驗(yàn)：分別用3家不同品牌、性能相當(dāng)色譜柱，調(diào)整柱溫（30±5℃）、流速（1.0 ml/min±20%）以及檢測(cè)波長（321±2nm），按照“3.1”項(xiàng)下的方法測(cè)定供試品溶液的含量。結(jié)果：主峰的拖尾因子小于2.0，主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度大于1.5，各條件下含量的RSD=0.60%。

3.13 含量測(cè)定：分別取不同批次的供試品溶液5ml，置10ml量瓶中，按“3.2”項(xiàng)制備供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 展開系統(tǒng)的考察：參考《中國藥典》2015年版一部“前胡”[1]265、“咳喘順丸”[1]1185項(xiàng)下“前胡”及相關(guān)文獻(xiàn) 的 鑒 別 ；“ 甘 草 ”[1]86、“ 三 拗 片 ”[1]491、“ 小 兒 止 咳 糖漿”[1]526項(xiàng)下“甘草”的鑒別，分別用三種不同的展開系統(tǒng)對(duì)前胡和甘草進(jìn)行考察。結(jié)果表明，分別以石油醚（60～90℃）-二氯甲烷-乙酸乙酯（4∶2∶1）、乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑時(shí)，前胡及甘草展開效果更佳。

4.2 薄層板的考察：比較國產(chǎn)硅膠G、H、GF254、煙臺(tái)江友高效硅膠G薄層板（HSG）對(duì)展開效果的影響。結(jié)果表明，硅膠板是否有熒光劑或黏合劑對(duì)分離效果及比移值差異不大。

4.3 溫濕度的考察：分別將層析缸置于4℃冰箱、25℃培養(yǎng)箱及40℃培養(yǎng)箱中用以考察溫度對(duì)供試品溶液、對(duì)照品溶液及對(duì)照藥材溶液的展開效果；用硫酸溶液將層析缸的相對(duì)濕度控制在42%和72%來考察不同濕度的展開效果。結(jié)果表明，低溫和高溫以及各相對(duì)濕度對(duì)分離效果略有影響，但差異不大。

4.4 其他藥材的薄層色譜鑒別考察：荊芥的特征成分主要為揮發(fā)性成分，本品采用煎煮方式進(jìn)行提取，揮發(fā)油損失較大，因此未能在該合劑中鑒別出荊芥藥味。本實(shí)驗(yàn)選用不同的展開系統(tǒng)對(duì)麥冬對(duì)照藥材、供試品溶液及缺麥冬的陰性供試品溶液進(jìn)行研究，結(jié)果顯示陰性有干擾，因此并未找到鑒別麥冬的專屬性方法。