徐田紅 單筠筠 許愛娥 葉益萍 徐世芳#

1 杭州市第三人民醫(yī)院 浙江 杭州 310016

2 杭州醫(yī)學院藥物研究所 浙江 杭州 310013

馬齒莧(Portulace oleraceaL.)為馬齒莧科馬齒莧屬一年生肉質(zhì)草本植物，具有清熱解毒、涼血止血的功效。近年來，馬齒莧外用治療皮膚疾病的作用日益受到重視，其所含的去甲基腎上腺素（NA）、多巴胺(DA)等兒茶酚胺類物質(zhì)，具有抗過敏、收縮皮膚毛細血管的效應，是抗皮膚過敏的主要活性成分。兒茶酚胺類物質(zhì)具有光熱不穩(wěn)定性，極易被破壞而失去活性，但新鮮馬齒莧能盡量保留這些活性成分，具有更好的抗皮膚過敏優(yōu)勢。本文采用高效液相色譜法（HPLC法）測定了新鮮馬齒莧榨汁凍干提取物中的NA和DA的含量，為新鮮馬齒莧的臨床應用及開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器：SKG-19911榨汁機（SKG）；TDL-40C低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；BCD-207C立式冰箱（小天鵝）；DW-86L386超低溫保存箱（海爾），F(xiàn)reeZone Plus 6 L冷凍干燥機（美國LABCONCO）；BP 211D型分析電子天平（德國賽多利斯公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），色譜柱為ZORBAX SBC18（4.6mm×150mm，5μm），DAD檢測器。

1.2 藥材與對照品：鮮馬齒莧由杭州之浦農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司種植，經(jīng)浙江省醫(yī)學科學院李曉譽研究員鑒定為Portulace oleraceaL.的新鮮地上部分。重酒石酸去甲腎上腺素對照品（批號：100169-201404，按C8H11NO3.C4H6O6計，純度為94.3%）、鹽酸多巴胺對照品（批號：100070-201507，按C8H11NO2.HCl計，純度為99.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院。水為娃哈哈純凈水；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 馬齒莧提取物的制備：新鮮馬齒莧15.3kg以榨汁機榨汁，過濾，濾液在4℃冰箱冷藏過夜。冷藏液離心（3500rpm，10min）后，取上清液，再經(jīng)濾紙過濾得澄清溶液，冷凍干燥，共得新鮮馬齒莧干燥提取物117g。將馬齒莧干燥提取物以適量純水溶解，放置在4℃冰箱冷藏48h，冷藏液離心（3500rpm，10min），取上清液冷凍干燥，共得到馬齒莧干燥提取物64g（取少量提取物用水溶解，呈澄清溶液）。

2.2 鮮馬齒莧干燥提取物中NA、DA的含量測定：分述如下。

2.2.1 混合對照品溶液的制備：①取重酒石酸去甲腎上腺素對照品適量，精密稱定，加0.1M鹽酸溶液制成相當于每毫升含0.3mg的去甲腎上腺素溶液。②取鹽酸多巴胺對照品適量，精密稱定，加0.1M鹽酸水溶液制成相當于每毫升含1mg的多巴胺溶液。將①和②精密吸取1ml和0.1ml置10ml容量瓶中，用0.1M鹽酸水溶液定容至刻度，搖勻，則每毫升混合對照品溶液含30g去甲腎上腺素和10g多巴胺。

2.2.2 供試品溶液的制備：取本品約0.5g，精密稱定，置25ml量瓶中，用0.1M鹽酸水溶液溶解并定容，搖勻，0.45m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液。

2.2.3 色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；流 動 相 為 甲 醇 -水 [57.5∶47.5，含30mmol/L十二烷基硫酸鈉和0.02M磷酸二氫鉀（pH=3.0）]；檢測波長為280nm；流速為1.0ml/min；進樣量為10μl；柱溫為40℃；數(shù)據(jù)處理定量方法：外標峰面積法。將混合對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀檢測。

2.2.4 方法學考察：①線性關系考察：精密稱取重酒石酸去甲腎上腺素對照品20.35mg（相當于去甲腎上腺素10.208mg），鹽酸多巴胺對照品19.11mg（相當于多巴胺15.436mg）同置10ml量瓶中，加0.1M鹽酸水溶液溶解并稀釋至刻度，則混合對照品溶液中去甲基腎上腺素（NA）和多巴胺（DA）的濃度分別為962.6μg/ml和1540.5μg/ml；將上述混合對照品溶液用0.1M鹽酸水溶液依次精密稀釋。吸取上述混合對照品溶液10μl，按“2.2.3”項下色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標（x），相應峰面積的峰面積值為縱坐標（y），得NA和DA的回歸方程分別為 y=10.122x-0.4503（R2=1）和 y=10.366x-2.415（R2=1），說明NA和DA進樣濃度分別在0.0963～481.29μg/ml和0.1541～770.25μg/ml范圍內(nèi)，均與各自峰面積之間呈良好的線性關系。②精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件依法重復測定6次，NA峰面積的RSD為0.03%；DA峰面積的RSD為1.89%。表明儀器精密度良好。③重復性試驗：取“2.1”項下制備的樣品6份，按“2.2.2”項下配制供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件依法測定，樣品中NA的平均值為0.13%，RSD為1.06%；DA的平均值為0.13%，RSD為1.87%。結果表明，本方法重復性良好。④加樣回收率試驗：取同一批樣品6份，每份約0.25g，精密稱定，置25ml量瓶中，精密加入混合對照品溶液500 ml（按“2.2.1”項下制備，對照品混合液含NA為715.2μg/ml和DA為404.7μg/ml），以0.1M鹽酸水溶液溶解并定容，搖勻，0.45m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.2.3”項下色譜條件依法測定，結果見表1。

表1 NA和DA的回收率結果

2.2.5 樣品測定結果：該批馬齒莧提取物中去甲基腎上腺素和多巴胺的含量分別為0.13%和0.03%。

3 討論

馬齒莧又名馬齒菜、螞蟻菜、長壽菜、五行草等，是一種藥食兼用的常用中藥，馬齒莧首載于《本草經(jīng)集注》，《本草綱目》言其有“散血消腫,利腸滑胎,解毒通淋,治產(chǎn)后虛汗”之功，其味酸性寒,無顯著毒副作用,可清熱解毒、涼血消腫、利水去濕、殺蟲止癢。該藥肥嫩多汁，在皮膚病方面，民間常用鮮品取汁外用治療濕疹、燙傷、丹毒、腫瘍、扁平疣、帶狀皰疹、黃褐斑、痤瘡、臁瘡、白癜風、蛇蟲咬傷等[1]，是中醫(yī)藥治療皮膚過敏的佳品。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧具有抗過敏、抗菌、抗氧化、抗炎、促進傷口愈合等藥理作用[1-2]。去甲基腎上腺素、多巴胺等兒茶酚胺類生物堿，是馬齒莧抗過敏的主要活性成分，這些成分在干燥和水煎過程中極易遭受破壞，導致抗過敏作用的降低。在前期研究中，我們用鮮馬齒莧榨汁冷噴治療面部敏感性皮膚，取得了不錯的臨床療效[3]。在該研究中，筆者用鮮馬齒莧榨汁、冷凍干燥，制備馬齒莧提取物，不接觸任何有機溶劑，盡可能保存有效的兒茶酚胺類物質(zhì)和保證提取過程的綠色天然；并采用高效液相色譜法證實提取物中含有較高的去甲基腎上腺素、多巴胺，含量分別為0.13%和0.03%。研究結果提示，通過對馬齒莧鮮品進行冷凍、干燥取汁外用有助于保存活性成分，從而提高抗過敏臨床效果。