卜賀啟 蔡 珂 吳 霜 沈 鋒

浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

便秘的患病率受多種要素的影響，一般社會人群中便秘患病率約為20%。其中有15%～42%功能性便秘的患者存在慢傳輸型便秘（STC），且與糞便緩慢輸送有關(guān)[1]。盡管目前對于STC的病理機(jī)制有了一定研究，但具體的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白（AQPs）在水體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)異常也是一個與便秘相關(guān)的病理機(jī)制。AQPs具有水和甘油選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，遍及于消化系統(tǒng)的各個組織和器官中，其中AQP-1、2、3、4、5、7、8、9、10、12廣泛分布于腸道上，并且參與腸道疾病的發(fā)生發(fā)展。研究已證實(shí)中醫(yī)藥治療STC，不僅可改善便秘臨床癥狀，還可調(diào)理胃腸道性能，改善患者的生活質(zhì)量。為此，我們探討?zhàn)B陰潤腸方對STC的治療效果及作用機(jī)制，為其臨床的進(jìn)一步推廣提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 材料：RNA試劑盒（DP419，TIANGEN公司）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1633，PeproTech公司）；qPCR試劑Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（RK21203，Sigma公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0015S，Sigma公司）；AQP8抗體（ab248604，ABclonal公司）；AQP3抗體（ab153694，ABclona公司）；HRP標(biāo)記二抗（ab9482，AB-clonal公司）；其他試劑（abcam公司）。

1.2 臨床資料：選取我院2016年6月～2018年6月期間門診和住院部確診的符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的STC患者80例，隨機(jī)分為觀察組和對照組，每組40例，年齡在18～65歲，病程在0.5～10年。觀察組男17例，女23例；平均年齡48.3±3.2歲；平均病程5.6±1.2年。對照組男19例，女21例；平均年齡45.2±0.4歲；平均病程5.1±0.9年。兩組患者在性別、年齡、病程等方面之間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果無明顯差異（P＞0.05），具有可比性。診斷標(biāo)準(zhǔn)：西醫(yī)、中醫(yī)診斷分別參考《羅馬Ⅳ：功能性胃腸疾病國際標(biāo)準(zhǔn)》[2]和《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[3]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合羅馬Ⅳ便秘診斷標(biāo)準(zhǔn)中STC診斷；②結(jié)腸傳輸試驗(yàn)、排糞造影等檢查證實(shí)者；③18～65周歲，男女不限；④簽署知情同意書；⑤中醫(yī)辨證為陰虛腸燥證者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①服從性差，不按規(guī)定用藥者；②便秘因消化道器質(zhì)病變致腸腔梗阻等特異性疾病所致；③既往有瀉藥史、腹部或結(jié)腸切除術(shù)史；④中藥湯劑過敏者、妊娠期、哺乳期婦女；⑤合并有基礎(chǔ)疾病，如糖尿病、心臟疾病、免疫缺陷，消化系統(tǒng)和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)疾病以及精神疾病患者。

1.3 治療方法：觀察組予以養(yǎng)陰潤腸方：生白術(shù)30g，炙升麻、炒枳殼、六神曲各15g，玄參、生地、生麥冬、郁李仁、火麻仁、瓜蔞仁各20g。水煎服，為避免患者各自煎煮的差異，由我院中藥房統(tǒng)一煎煮成袋裝發(fā)放，每日2次，每次1包。本方獲得浙江省中醫(yī)藥研究院倫理委員會批準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)號：XMSC2016026。對照組予以聚乙二醇散劑，即福松（博福，進(jìn)注號H20110130）口服，每日2次，每次2包（20g）。兩組均治療3個療程，每個療程7天。

1.4 評價指標(biāo)：①一般觀察指標(biāo)：觀察組和對照組分別及時記錄治療前后患者生活質(zhì)量自評表（PAC-QOL）及慢性便秘嚴(yán)重程度評分表（CCS），以及伴隨的其他臨床癥狀（包括頭暈?zāi)垦?、口干咽干、干咳、目干、腰酸耳鳴健忘、尿少尿黃、手足心熱、大便干燥、睡眠差）等（備注：次要癥狀有為1分；無為0分）。②安全性評價指標(biāo)：治療前后均檢測血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)、肝臟腎臟功能、凝血功能、心電圖，胸片。③隨訪：對治愈患者進(jìn)行停藥后2個月的隨訪，評估其效果。

1.5 療效評估：參照《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》中便秘的療效標(biāo)準(zhǔn)[4]。治愈：2天內(nèi)可有排便1次及以上，便質(zhì)變成潤澤，大便通暢，伴隨癥狀消失，短期內(nèi)無復(fù)發(fā)；顯效：2天內(nèi)可有排便，便質(zhì)變得干結(jié)或接近正常，排便不平滑，伴隨癥狀大部分緩解或消失；有效：3天內(nèi)有排便，便質(zhì)變得松軟或先干結(jié)后軟，排便不平滑，伴隨癥狀部分緩解或消失；無效：癥狀無改善。

1.6 Western Blot檢測：按照說明提取患者結(jié)腸黏膜總蛋白，在RIPA裂解緩沖液中溶解和勻漿。BCA蛋白檢測試劑盒測定最終蛋白濃度，從每個樣品中提取等量總蛋白（40μg/每通道），用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉2h，洗膜后加入相應(yīng)抗 AQP3、AQP8、GAPDH抗體（均1∶1000稀釋）4℃過夜，洗膜3次，然后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗（1∶1000）室溫下孵2h。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測系統(tǒng)和成像系統(tǒng)檢測。

1.7 熒光定量PCR：用TRIzol試劑提取組織中RNA，分光光度法對其純度進(jìn)行測定，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，將含有SYBR Green的反應(yīng)液在PCR檢測系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃，3min（預(yù)變性）→95℃，10s→60℃，30s→72℃，30s下進(jìn)行40個循環(huán)，最后在72℃延長10min。反應(yīng)結(jié)束后立即繪制溶解曲線，SYBR Green檢測熒光改變，2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列如下：

其中AQP3引物大小為708bp，AQP8引物大小為556bp，GAPDH引物大小為482bp。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行兩組和多組間的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療對CCS便秘評分、PAC-QOL評分以及伴隨次要癥狀的影響：治療前兩組患者的CCS便秘評分、PAC-QOL評分以及伴隨次要癥狀無明顯差異（P＞0.05）；治療后兩組患者的CCS便秘評分、PAC-QOL評分以及伴隨的次要癥狀較治療前相比較均有所下降，但觀察組的各項(xiàng)評分均低于對照組（P＜0.05），見表1、表2。

表1 兩組治療前后PAC-QOL評分、CCS便秘評分比較（±s，分）

表1 兩組治療前后PAC-QOL評分、CCS便秘評分比較（±s，分）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

CCS便秘評分11.17±5.74 5.60±4.68*10.05±5.14 7.60±4.68組別 例數(shù)觀察組40對照組40時間治療前治療后治療前治療后PAC-QOL評分79.48±20.45 62.02±14.83*78.23±18.63 70.02±16.72

表2 兩組治療前后伴隨次要癥狀情況比較（±s，分）

表2 兩組治療前后伴隨次要癥狀情況比較（±s，分）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別觀察組（40例）對照組（40例）時間治療前治療后治療前治療后頭暈?zāi)垦?.19±0.39 0.07±0.20*0.20±0.25 0.10±0.30口干咽干0.22±0.41 0.05±0.21*0.21±0.54 0.08±0.26干咳0.13±0.34 0.04±0.26*0.14±0.63 0.05±0.22目干0.15±0.36 0.06±0.18*0.16±0.63 0.08±0.28腰酸耳鳴健忘0.22±0.41 0.14±0.27*0.21±0.14 0.16±0.37尿少尿黃0.14±0.35 0.03±0.13*0.13±0.55 0.04±0.19手足心熱0.11±0.31 0.05±0.25*0.12±0.41 0.07±0.25大便干燥0.33±0.47 0.07±0.27*0.34±0.56 0.13±0.34睡眠差0.18±0.39 0.08±0.24*0.20±0.47 0.11±0.32

2.2 兩組臨床療效情況：治療后，觀察組治愈17例，顯效12例，有效6例，無效5例，總有效率87.5%；對照組治愈8例，顯效10例，有效13例，無效9例，總有效率77.5%。兩組總有效率比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 兩組安全評估情況：治療前后兩組患者血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)、肝腎功能、凝血功能、心電圖、胸片均未見明顯變化（P＞0.05）。

2.4 兩組治療后復(fù)發(fā)率情況：停藥2月后，觀察組治愈17例，復(fù)發(fā)3例（17.65%）；對照組治愈8例，復(fù)發(fā)4例（50.00%）。觀察組復(fù)發(fā)率低于對照組（P＜0.05），短期療效優(yōu)于對照組。

2.5 AQP3和AQP8在兩組的基因表達(dá)情況：相對于治療前，兩組治療后AQP3和AQP8基因表達(dá)量均增加（P＜0.05）；但觀察組治療后AQP3和AQP8基因表達(dá)量上升顯著（P＜0.01）。見圖1。

圖1 QPCR檢測兩組AQP3、AQP8的水平變化

2.6 AQP3和AQP8在兩組的蛋白表達(dá)情況：相對于治療前，兩組治療后AQP3和AQP8蛋白表達(dá)量均增加（P＜0.05）；但觀察組治療后AQP3和AQP8蛋白表達(dá)量與基因表達(dá)量上升顯著（P＜0.01）。見圖2。

圖2 兩組AQP3、AQP8蛋白電泳圖及灰度值統(tǒng)計(jì)圖

3 討論

STC是慢性功能性便秘患者中很普遍的一種類型，在人群中占相當(dāng)大的比例，其治愈率較低，臨床癥狀頑固，病情時常反復(fù)，少數(shù)患者最終需要手術(shù)干預(yù)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，STC患者多因久服瀉劑導(dǎo)致大腸蠕動功能降低，加上火燥、風(fēng)寒等病理因素引起排便困難。其主要病機(jī)為陰血虧虛，運(yùn)行無力，腸燥失濡而致大便秘結(jié)，治療上主要以養(yǎng)陰潤腸通便為主。本研究應(yīng)用養(yǎng)陰潤腸方的配伍原則參照養(yǎng)陰潤腸方用藥分析[5]。驗(yàn)方10味中藥，有3味養(yǎng)陰藥（玄參、麥冬、生地黃），3味潤腸藥（火麻仁、郁李仁、瓜蔞仁），占到全方60%。其他用藥，如生白術(shù)、升麻、枳殼等，都是治療便秘的經(jīng)典特色用藥。整個組方可以起到養(yǎng)陰潤腸通便的功效，與西藥治療相比較，明顯減少了瀉下猛攻藥物的用量，對腸道刺激作用小，藥效溫和，可因人而異，對癥下藥。本研究表明，養(yǎng)陰潤腸方較福松能明顯降低患者的PAC-QOL評分、CCS便秘評分以及伴隨的次要癥狀，能改善患者的便秘癥狀及短期復(fù)發(fā)率。

目前的研究表明，水通道蛋白與STC的發(fā)生可能有關(guān)，為STC的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究方向。至少有13種AQP亞型（AQP0～12）在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)，其中研究已證實(shí)AQP3、AQP8與結(jié)腸的水轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)[6]。通過進(jìn)一步檢測觀察組與對照組標(biāo)本中AQP3、AQP8基因與蛋白的變化，筆者發(fā)現(xiàn)觀察組與對照組治療后AQP3、AQP8基因與蛋白表達(dá)較治療前明顯增加，這與之前的報(bào)道相符[7]。提示AQP3、AQP8的改變可能與STC的改善有一定關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果表明，養(yǎng)陰潤腸方能促進(jìn)排便，顯著緩解功能性便秘人群的便秘癥狀，改善便秘人群的生活質(zhì)量，其可能的機(jī)制與水通道蛋白AQP3、AQP8的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。此研究為開發(fā)中藥靶點(diǎn)藥物開啟道路，但其臨床研究的遠(yuǎn)期效果及進(jìn)一步推廣有待大樣本的研究支撐。