魏后軍 胡波 陳萌萌 范志宇 宋艷華 仇汝龍 朱偉峰 王芳

摘要：為分析RBM4基因在新西蘭兔不同組織的表達差異情況，本研究根據(jù)GenBank中公布的穴兔RBM4基因序列設計了特異性引物，從兔腎臟中擴增出RBM4基因并進行了生物信息學分析，同時采用實時熒光定量PCR技術研究了RBM4基因在新西蘭兔各組織中的表達差異。結果表明，擴增出的新西蘭兔RBM4基因長度為1 080 bp，編碼359個氨基酸。序列比對結果顯示，新西蘭兔與穴兔、牛、鼠、人、鮭魚等動物RBM4基因的核苷酸一致性為44.1%～99.8%。進化樹分析結果表明，新西蘭兔RBM4基因與其他哺乳動物RBM4基因親緣關系較近。實時熒光定量PCR結果顯示，RBM4基因在新西蘭兔的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦中均有表達，其中在腎臟中表達量最高，在腦中表達量最低。本研究成功克隆了新西蘭兔RBM4基因，并研究了其mRNA在兔各組織中的表達情況，為研究兔RBM4基因的表達及其生物學功能奠定了基礎。

關鍵詞：RBM4基因;克隆;序列分析;表達;新西蘭兔

中圖分類號： S852.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2021）02-0033-04

收稿日期：2020-11-09

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（編號：CARS-43-C-1）。

作者簡介：魏后軍（1986—），男，江蘇南京人，碩士，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫(yī)生物技術研究。E-mail：whj280941235@126.com。

通信作者：王芳，博士，研究員，主要從事家兔重要疫病致病機制及防控技術研究。E-mail：rwangfang@126.com。

RNA結合基序蛋白4（RNA binding motif protein4，RBM4）是一種多功能RNA結合蛋白，參與多種轉錄后調(diào)控過程，包括前體mRNA（pre-mRNA）的選擇性剪接、翻譯控制等[1]。人RBM4含有364個氨基酸，分子大小約40 ku，N端含有2個RNA識別基序（RNA recognition motifs，RRMs）和1個CCHC型鋅指結構，RRMs是結合RNA的主要位點;C端有3個富含丙氨酸的延伸，具有RBM4的細胞定位及與其他蛋白質(zhì)互作的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，RBM4可以在果蠅中調(diào)控晝夜規(guī)律[3];能促進人的肌細胞[4]、胰腺細胞[5]、神經(jīng)元細胞[6]、棕色脂肪細胞[7]分化;目前，RBM4的研究主要集中在細胞凋亡、增殖，以及炎癥反應等方面[8-10]。兔作為一種重要的試驗動物，其RBM4基因的相關研究尚未開展。本試驗以新西蘭兔為研究對象，克隆RBM4基因并進行分析，以期為研究兔RBM4基因的表達及其生物學功能和在相關疾病中的作用奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗時間與地點

試驗于2020年10月12—23日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所完成。

1.2主要試劑

RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ、核酸凝膠回收試劑盒，均購自TaKaRa公司;DEPC水，購自索萊寶公司;DNA Marker DL2000、2×Phanta Max Master Mix （Dye Plus）、Universal Ligation Mix試劑盒、Escherichia coli DH5α感受態(tài)細胞，均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3試驗動物及樣品采集

2月齡新西蘭兔2只，購自江蘇省明天農(nóng)牧科技有限公司，耳靜脈空氣針處死后，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦等組織，置于-80 ℃保存。

1.4引物設計

根據(jù)GenBank上公布的穴兔RBM4基因序列（NO. AF233063），利用Primer 5.0軟件設計用于擴增新西蘭兔RBM4基因的特異性引物（表1），由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.5RNA的提取及cDNA的合成

使用RNAiso Plus提取新西蘭兔心臟、 肝臟、脾表1引物信息

基因引物序列（5′→3′）片段大小

（bp）RBM4F：ATGGTGAAGCTGTTCATCGGAAAC;R：CCGCAATTATCCTACCTCCAGTT1 104RBM4（qPCR）F：AGATCCGCTCGCTGTTCGA;R：AAGCCTTGCTCTTGTTCTTGCTG180GAPDHF：GAATCCACTGGCGTCTTCAC;R：CGTTGCTGACAATCTTGAGAGA160

臟、肺臟、腎臟和腦組織懸液的總RNA，以PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行基因組DNA的去除和cDNA的合成。反轉錄反應條件：37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6聚合酶鏈式反應（PCR）

以新西蘭兔肝臟提取的cDNA為模板進行PCR。反應體系：cDNA 4 μL，2×Phanta Max Master Mix （Dye Plus） 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各 2 μL，加ddH2O 至總體積50 μL。反應條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃ 5 min。反應結束后于1.0%瓊脂糖凝膠電泳中檢測，120 V，40 min，紫外燈下觀察結果。

1.7目的片段克隆及測序

采用核酸凝膠回收試劑盒回收并純化PCR產(chǎn)物，利用Universal Ligation Mix試劑盒將目的片段克隆入載體，轉化E. coli DH5α感受態(tài)細胞，在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑選單菌落，經(jīng)PCR鑒定后，挑選3個陽性克隆送至南京擎科生物科技有限公司測序。

1.8生物信息學分析

對測序結果以DNAStar程序進行同源性分析，并采用MEGA 7軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.9熒光定量PCR（qPCR）檢測

以2只新西蘭兔不同組織提取的cDNA為模板，兔GAPDH基因為內(nèi)參基因，按ABI Q1 PCR儀的反應體系和條件進行實時熒光定量PCR檢測。反應體系：TB GreenTM Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板 2 μL，加ddH2O至總體積20 μL。擴增程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)，反應結束后確認擴增曲線和熔解曲線。每個樣品進行3次重復，使用相對定量的方法，采用2-ΔΔCT算法，計算RBM4在兔不同組織中的相對表達量。

1.10統(tǒng)計與分析

使用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行顯著性分析。

2結果與分析

2.1RBM4基因的擴增

以新西蘭兔腎臟總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，進行RBM4基因的PCR擴增。結果顯示，獲得大小約1 100 bp的預期條帶（圖1）。經(jīng)回收純化并與載體連接后，挑取陽性菌落進行測序，測序結果上傳GenBank數(shù)據(jù)庫（NO. MW196263）。

2.2RBM4基因序列

以DNAStar程序?qū)寺〉腞BM4基因序列進行分析，結果顯示，新西蘭兔RBM4基因全長 1 080 bp，編碼359個氨基酸。與GenBank上報道的穴兔、牛、鼠、人、鮭魚等各種屬動物RBM4基因的核苷酸一致性在41.1%～99.8%之間（表2），氨基酸一致性在29.8%～100%之間。

2.3RBM4基因遺傳進化

使用MEGA 7軟件對新西蘭兔、穴兔、人、牛、鼠、斑馬魚等的RBM4基因核苷酸序列進行遺傳進化分析，結果顯示，新西蘭兔與穴兔、人、黑猩猩、牛、綿羊、野豬、鼠等哺乳動物的親緣關系較近，并位于同一個大的分支，與爪蟾、斑馬魚、家蠶、鮭魚等的親緣關系較遠（圖2）。

2.4RBM4基因在新西蘭兔各組織中的表達

以檢測兔RBM4基因的特異性引物對新西蘭兔各組織的cDNA進行實時熒光定量PCR檢測，結果顯示，RBM4和GAPDH的熔解曲線為單峰，特異性良好（圖3）。RBM4 mRNA在兔心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦中均可檢測到，其中在腎臟中表達量最高，在腦中表達量最低。經(jīng)GraphPad Prism 5軟件進行單因素方差分析表明，RBM4基因在腦中的表達水平與在心臟和肺臟中的表達水平存在顯著性差異（P<0.05）;在脾臟、腎臟中的表達水平與腦中的表達水平之間存在極顯著性差異（P<0.01）（圖4）。

3討論

pre-RNA的選擇性剪接是形成蛋白多樣性的重要原因[11]。通過不同的mRNA的剪接異構體，編碼具有不同生物學功能的蛋白質(zhì);選擇性剪接因子分別在細胞、個體發(fā)育的不同階段、不同組織及不同生理、病理條件下，參與多種信號傳導、轉錄因子的表達、細胞凋亡等關鍵生理過程[12-13]。對選擇性剪接因子的研究有助于我們更深入地了解基因表達的方式、蛋白質(zhì)的功能及疾病的發(fā)生發(fā)展。

本研究首次通過PCR方法獲得了新西蘭兔RBM4基因，大小為1 080 bp。通過對新西蘭兔RBM4基因的序列分析，發(fā)現(xiàn)其與穴兔、牛、鼠、人等哺乳動物RBM4基因的一致性均高于80%，而與爪蟾、斑馬魚、家蠶、鮭魚等的一致性均低于60%。研究結果表明，在哺乳動物中，RBM4在進化過程中高度保守。隨后應用實時熒光定量PCR技術檢測了RBM4基因在新西蘭兔不同組織中mRNA的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)RBM4基因在新西蘭兔不同組織中的表達存在一定差異，其在脾臟和腎臟中表達量較高，在腦和肝臟中表達量較低，這與RBM4基因在人的組織中表達情況類似[14]。

本研究克隆了新西蘭兔RBM4基因，對其進行了生物信息學分析，并研究了其在新西蘭兔各組織中的表達差異，為以新西蘭兔作為研究對象或模型動物的RBM4相關研究奠定了基礎。

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