呂孫建 袁雪梅 張海琪 劉莉 于喆 杭小英 施偉達(dá)

摘要：近年，由于凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）養(yǎng)殖業(yè)疾病頻發(fā)，且病原種類復(fù)雜多樣，對對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的影響，其中又以細(xì)菌病最為普遍及嚴(yán)重。以浙江某養(yǎng)殖場的6口養(yǎng)殖塘作為試驗(yàn)塘，在養(yǎng)殖至20 d后開始分別采用水質(zhì)監(jiān)測試劑盒及高通量測序等方法連續(xù)監(jiān)測水質(zhì)指標(biāo)、水體及對蝦腸道微生物群變化情況，從而了解在對蝦疾病高發(fā)期水體和蝦體中微生物群的動(dòng)態(tài)規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)殖時(shí)間延長，水體中的氨氮、硫化氫、鈣離子、總氮和總磷等指標(biāo)會(huì)出現(xiàn)顯著上升。另外，養(yǎng)殖塘中的主要微生物群為藍(lán)藻細(xì)菌綱和變形菌綱類細(xì)菌，且藍(lán)藻細(xì)菌綱和γ-變形菌綱-弧菌微生物群到養(yǎng)殖后期數(shù)量顯著上升;對蝦腸道中的主要微生物群為γ-變形菌綱-弧菌，在養(yǎng)殖中期有明顯上升。本研究首次研究了在對蝦疾病高發(fā)期水體和蝦體中的主要微生物群種類，為后續(xù)病害防控技術(shù)研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦;微生物群;γ-變形菌綱;藍(lán)藻細(xì)菌綱

中圖分類號： S945.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2021）02-0125-06

收稿日期：2020-06-03

基金資助：浙江省科研院所扶持專項(xiàng)（編號：2020YSZX002、2020YSZX010）。

作者簡介：呂孫建（1988—），男，浙江溫州人，博士，助理研究員，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防治。E-mail：lvsunjian@163.com。

通信作者：張海琪，碩士，正高級工程師，主要從事水產(chǎn)育種和病害防治。E-mail：zmk407@126.com。

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目、旅游亞目、對蝦科、對蝦屬，是廣溫廣鹽性熱帶蝦類。該蝦具有個(gè)體大、生長快、營養(yǎng)需求低、抗病力強(qiáng)、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，是集約化高產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，也是目前世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類之一[1-2]。近年來，由于高密度養(yǎng)殖盛行、藥物濫用、養(yǎng)殖水體惡化和種質(zhì)退化等原因，凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)疾病頻發(fā)，且病原種類復(fù)雜多樣，包括病毒類、細(xì)菌類、寄生蟲類、真菌類和原生動(dòng)物類等，其中又以細(xì)菌病最為嚴(yán)重，如副溶血弧菌、霍亂弧菌、河流弧菌和其他細(xì)菌等條件致病性細(xì)菌均能導(dǎo)致對蝦大量死亡[3-5]。

自然條件下，對蝦養(yǎng)殖水體中的微生物群存在一定的動(dòng)態(tài)平衡，病毒、細(xì)菌、寄生蟲、真菌和原生動(dòng)物相互制約并保持水體的穩(wěn)定，但由于外來物質(zhì)，如過量飼料投喂、抗生素和化學(xué)藥物的濫用[6-7]：一方面擾亂對蝦的免疫系統(tǒng)，極大降低對蝦本身的免疫力;另一方面又導(dǎo)致水體營養(yǎng)成分失衡，水體和對蝦腸道內(nèi)的微生物群動(dòng)態(tài)平衡紊亂，病原微生物大量增殖，有益微生物大量減少。因此，研究現(xiàn)有養(yǎng)殖環(huán)境下，水體和對蝦腸道中微生物菌群的變化，對了解目前對蝦細(xì)菌性疾病暴發(fā)的原因和后續(xù)防控技術(shù)的研發(fā)具有深遠(yuǎn)的意義。據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道，目前關(guān)于凡納濱對蝦水體及腸道微生物群動(dòng)態(tài)變化的研究較少，只有少量文章涉及這方面的研究。孫振麗對凡納濱對蝦腸道和水體中的微生物群進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)水和蝦腸道中檢測到的共有細(xì)菌屬為119株，證明水體和腸道中細(xì)菌存在密切的相互作用[8]。宛立等通過分離純化培養(yǎng)法，從健康凡納濱對蝦腸道中檢測到111株細(xì)菌，但一些難以培養(yǎng)的優(yōu)勢菌種或低豐度菌種則檢測不出，因此研究結(jié)果不能全面地反映凡納濱對蝦腸道微生物的種群數(shù)量及多樣性[9]。李可和劉淮德分別用16S rDNA 克隆文庫法和變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)對凡納濱對蝦腸道菌群進(jìn)行檢測，均發(fā)現(xiàn)了12種細(xì)菌，其中李可發(fā)現(xiàn)厚壁細(xì)菌和變形細(xì)菌為對蝦腸道的優(yōu)勢菌，各占75.4%和246%[10-11]。

本研究擬用高通量測序技術(shù)對浙江某凡納濱對蝦養(yǎng)殖場進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，通過在凡納濱對蝦疾病高發(fā)期（養(yǎng)殖從20 d到50 d左右）連續(xù)監(jiān)測水體和對蝦腸道中的微生物菌群，了解養(yǎng)殖期間微生物的動(dòng)態(tài)變化，包括主要微生物種類的變化、各類微生物數(shù)量的波動(dòng)情況，為后續(xù)細(xì)菌性疾病研究和相應(yīng)防控產(chǎn)品研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1地點(diǎn)

本次研究以浙江某養(yǎng)殖場的6口凡納濱對蝦養(yǎng)殖塘為監(jiān)測點(diǎn)，從養(yǎng)殖20 d（7月11日）開始采集樣品并檢測，每周采集1次樣品，連續(xù)監(jiān)測5周，至養(yǎng)殖 48 d結(jié)束（8月8日）。

1.2方法

1.2.1樣品采集監(jiān)測塘口采集水樣和對蝦樣品：采集每口養(yǎng)殖塘中心處底層水樣500 mL并4 ℃保存，用于水質(zhì)檢測和水體微生物菌群檢測;隨機(jī)采集每口養(yǎng)殖塘對蝦20 尾，-80 ℃保存，用于對蝦菌群多樣性檢測。

1.2.2水質(zhì)檢測水質(zhì)檢測指標(biāo)包括水溫、溶解氧、pH值、氨氮（NH+4-N）、亞硝酸鹽（NO-2-N）、硫化氫（H2S）、總氮（TN）、總磷（TP）和鈣離子（Ca2+），其中，水溫、溶解氧和pH值采用美國哈希水質(zhì)分析儀檢測，剩余指標(biāo)分別使用試劑AmVerTM High Range Ammonia Reagent Set 2606945（0～50 mg/L）、NitriVer3亞硝酸鹽試劑、硫化物試劑盒、Total Nitrogen Hydroxide Reagent Set 2671745（0～25 mg/L）、Calcium Indicaator Solution for Low Range Colorimetric Hardness Test等進(jìn)行檢測。

1.2.3水體和對蝦腸道微生物菌群分析取各塘口底層水樣50 mL，0.22 μm濾膜過濾，收集濾膜于-80 ℃保存;另將收集的對蝦解剖后，取腸道于 -80 ℃ 保存。將樣品送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行核酸抽提、16S rDNA建庫和高通量測序。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析對全部樣品的 Effective tags進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成OTUs。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，對每個(gè)OTU的代表序列做物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息，根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣品在門、綱、目、科、屬5個(gè)分類級別上最大豐度排名前15的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖。分別統(tǒng)計(jì)各養(yǎng)殖水體的所有樣品中均存在的OTU，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另水質(zhì)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用 SPSS 11.0 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 時(shí)被認(rèn)為具有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1水質(zhì)指標(biāo)變化

從養(yǎng)殖20 d開始，至養(yǎng)殖48 d為止，監(jiān)測塘水溫、pH值、溶解氧、氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫、總氮、總磷、化學(xué)需氧量和鈣離子等指標(biāo)變化情況。由表1可知，水溫變化區(qū)間為25.8～29.7 ℃，平均水溫27.7 ℃;pH值變化區(qū)間為8.11～9.06，平均pH值8.52;溶解氧濃度的變化區(qū)間為4.30～10.89 mg/L，平均濃度為8.93 mg/L。

另由表1可知，氨氮、硫化氫、鈣離子和水體中的總氮和總磷隨養(yǎng)殖時(shí)間增加出現(xiàn)明顯上升：氨氮從養(yǎng)殖20 d時(shí)的0.26 mg/L升高至41 d時(shí)的 1.18 mg/L（P<0.05），隨后下降至0.75 mg/L;硫化氫從養(yǎng)殖20 d時(shí)的0.07 mg/L升高至41 d時(shí)的0.12 mg/L（P<0.05），隨后下降至0.06 mg/L;鈣離子持續(xù)上升，從養(yǎng)殖20 d時(shí)的6.10 mg/L升高至 41 d 時(shí)的31.44 mg/L（P<0.05）;總氮和總磷持續(xù)上升，總磷從養(yǎng)殖 20 d 時(shí)的0.39 mg/L升高至 0.52 mg/L（P<0.05）;總氮也從3.20 mg/L升高至4.90 mg/L（P<0.05）。

2.2水體微生物菌群變化

由圖1可知，菌群分析結(jié)果顯示，該監(jiān)測點(diǎn)水體中的微生物分屬于53綱，主要微生物菌群包括藍(lán)藻細(xì)菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱-弧菌、放線菌綱、酸微菌綱、綠藻綱、Δ-變形菌綱、鞘脂桿菌綱、暖繩菌綱、黃桿菌綱和綠菌綱12個(gè)綱，整個(gè)監(jiān)測周期內(nèi)合計(jì)占總微生物群體的比例達(dá)到79.62%，其他微生物占比20.38%。

由表2和圖2可知，藍(lán)藻細(xì)菌綱微生物占比最多，平均占比17.72%，高峰時(shí)占比達(dá)23.81%，其次為 α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱（弧菌科），占比分別達(dá)12.23%、9.33%和7.98%。水體中藍(lán)藻細(xì)菌綱、γ-變形菌綱-弧菌、暖繩菌綱、Δ-變形菌綱和鞘脂桿菌綱微生物隨著養(yǎng)殖時(shí)間推移，占比均有不同程度增加，其中，藍(lán)藻細(xì)菌綱微生物群占比從養(yǎng)殖20 d時(shí)的10.40%上升至41 d時(shí)的23.81%;γ-變形菌綱-弧菌微生物群占比則從743%上升至10.05%;暖繩菌綱微生物群占比從1.25%上升至7.69%;Δ-變形菌綱微生物群占比從2.79%上升至5.15%;鞘脂桿菌綱微生物群占比從2.37%上升至6.84%。暖繩菌綱微生物群波動(dòng)最大，其占比變化區(qū)間為0.12%～1.75%，最高值為最低值的14.82倍，其次分別為暖繩菌綱、鞘脂桿菌綱、黃桿菌綱、放線菌綱、綠藻綱、藍(lán)藻綱、β變形菌綱、酸微菌綱、Δ-變形菌綱和α變形菌綱，而 γ-變形菌綱-弧菌占比變化最小，其變化區(qū)間為684%～1005%，最高值為最低值的1.47倍。

2.3對蝦腸道微生物菌群變化

由圖3可知，該監(jiān)測點(diǎn)對蝦腸道中的微生物分屬于42綱，主要微生物菌群包括γ-變形菌綱-弧菌、桿菌綱、β-變形菌綱、黃桿菌綱、α-變形菌綱、梭菌綱和藍(lán)藻細(xì)菌綱7個(gè)綱的微生物群，合計(jì)占總微生物群體的比例達(dá)80.62%，其他微生物占比1938%。

由表3和圖4可知，γ-變形菌綱-弧菌占比最多，平均占比26.35%，高峰時(shí)占比達(dá)46.24%，其次為桿菌綱和β-變形菌綱，占比分別達(dá)15.28%和14.48%。對蝦腸道中γ-變形菌綱-弧菌、α-變形菌綱和藍(lán)藻細(xì)菌綱微生物隨養(yǎng)殖時(shí)間推移，占比均有不同程度的增加，其中，γ-變形菌綱-弧菌微生物群從養(yǎng)殖20 d時(shí)的26.79%上升至34 d時(shí)的4624%;α-變形菌綱微生物群從養(yǎng)殖20 d時(shí)的211%上升至41 d時(shí)的12.31%，隨后下降至539%;藍(lán)藻細(xì)菌綱微生物群從養(yǎng)殖20 d時(shí)的038%上升至48 d時(shí)的7.42%。藍(lán)藻細(xì)菌綱微生物群波動(dòng)最大，其占比變化區(qū)間為0.38%～742%，最高值為最低值的19.53倍，其次分別為梭菌綱、β-變形菌綱、α-變形菌綱、黃桿菌綱和γ-變形菌綱-弧菌，而桿菌綱微生物群占比變化最小，其變化區(qū)間為558%～10.72%，最高值為最低值的1.92倍。

3討論

凡納濱對蝦由于生活于水體環(huán)境中，與水體中的微生物群及水體物理環(huán)境直接接觸，因此兩者變化極易影響凡納濱對蝦的健康狀態(tài)。由于近年來抗生素、水質(zhì)調(diào)節(jié)劑及微生態(tài)制劑濫用，導(dǎo)致水體微生態(tài)環(huán)境紊亂、水生動(dòng)物疾病頻發(fā)。

本研究對浙江某凡納濱對蝦養(yǎng)殖場對蝦養(yǎng)殖至20 d后蝦塘的水質(zhì)、水體及蝦體微生態(tài)菌群進(jìn)行檢測，了解疾病高發(fā)期水體及蝦體中微生態(tài)菌群的變化規(guī)律。王興強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦在pH值為7.5～8.5、溶解氧含量為6.8 mg/L的水體中生長較好，溶解氧含量低于4 mg/L則會(huì)限制對蝦的生長[12]。本研究中，養(yǎng)殖20～48 d內(nèi)，水體中的水溫和pH值均較為穩(wěn)定，平均水溫和pH值分別為27.7 ℃和8.52，而溶解氧最低濃度為4.30 mg/L，平均濃度為 8.93 mg/L，雖然沒有一直維持在最適范圍內(nèi)，但基本能保證對蝦正常生長[13]。而氨氮、硫化氫、鈣離子和水體中的總氮和總磷含量隨著養(yǎng)殖時(shí)間增加出現(xiàn)顯著上升，最高時(shí)分別上升至118、0.12、31.44、052、4.90 mg/L，較最低的時(shí)候分別上升4.54、1.71、5.15、1.50、1.30倍，這與養(yǎng)殖戶投喂情況相關(guān)，隨養(yǎng)殖期的發(fā)展，水體中殘余飼料、排泄物、浮游動(dòng)物尸體等有機(jī)物逐漸增多不斷分解使得COD不斷增高，相應(yīng)的水體中的有機(jī)物分解產(chǎn)物，如氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)含量均會(huì)明顯上升，并會(huì)對幼蝦及成體蝦造成毒害[14-15]。

菌群分析結(jié)果顯示，對蝦養(yǎng)殖塘水體中的微生物菌群分屬于53綱，主要種類有12綱，合計(jì)占總微生物群體的比例達(dá)79.62%，其中藍(lán)藻細(xì)菌綱微生物占比最多，平均占比17.72%，高峰時(shí)占比達(dá)2381%，其次為α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱（弧菌科），占比分別達(dá)到12.23%、9.33%和798%。該結(jié)果與之前同類研究類似，羅鵬等研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，以變形菌綱類微生物群為主，其中又以α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱（弧菌科）為主[16];Zeng等學(xué)者也發(fā)現(xiàn)變形菌綱為水體中最主要的細(xì)菌類群[17-18]。本研究還發(fā)現(xiàn)，水體中的藍(lán)藻細(xì)菌綱微生物群占比較高，其占比甚至高于變形菌綱微生物群，這與水體富營養(yǎng)化嚴(yán)重導(dǎo)致的藍(lán)藻泛濫有關(guān)[17-18]。隨養(yǎng)殖時(shí)間推移，水體中的微生物菌群也有一定變化，其中藍(lán)藻細(xì)菌綱和γ-變形菌綱-弧菌微生物群變化最為明顯，分別從10.40%和743%上升至23.81%和10.05%，這可能與水體中水質(zhì)指標(biāo)變化有關(guān)，后期養(yǎng)殖水體中的總氮、總磷等營養(yǎng)鹽均有明顯上升。此外，暖繩菌綱微生物群波動(dòng)最大，其占比變化區(qū)間為0.12%～1.75%，最高值為最低值的14.82倍，而γ-變形菌綱-弧菌波動(dòng)最小，最高值為最低值的1.47倍，說明弧菌在水體中較為穩(wěn)定，數(shù)量變化不如其他微生物群容易受環(huán)境變化的影響。

而蝦體腸道中的微生物分屬于42綱，主要種類有7綱，合計(jì)占總微生物群體的比例達(dá)到80.62%，其中，γ-變形菌綱-弧菌占比最多，平均占比2635%，說明γ-變形菌綱-弧菌是凡納濱對蝦腸道中的主要微生物菌群，其次為桿菌綱和β-變形菌綱。這與之前的研究結(jié)果類似，如Beardsley、Liu和Rungrassamee等研究均表明，γ-變形菌綱在對蝦腸道內(nèi)占絕對優(yōu)勢，且弧菌屬、氣單胞菌屬為絕對優(yōu)勢屬，且隨著養(yǎng)殖時(shí)間增加，腸道中的變形菌綱和藍(lán)藻細(xì)菌綱微生物菌群占比均有顯著增加[19-21]。不過也有部分研究發(fā)現(xiàn)，γ-變形菌綱并非對蝦腸道優(yōu)勢菌群，如Tang等分析發(fā)現(xiàn)了凡納濱對蝦腸道細(xì)菌種群，放線菌門、未分類細(xì)菌門、變形菌門和擬桿菌門是優(yōu)勢菌門，分別占比為53.5%、22.4%、188%和4.32%。所以不同品種的蝦，由于生活環(huán)境的差異，可能導(dǎo)致腸道定殖的細(xì)菌種類存在差異[22]。

總結(jié)本研究發(fā)現(xiàn)，隨著養(yǎng)殖時(shí)間增加，飼料投喂量增加，水體中的氨氮、硫化氫、鈣離子、總氮和總磷等指標(biāo)會(huì)出現(xiàn)顯著上升。養(yǎng)殖塘中的主要微生物群為藍(lán)藻細(xì)菌綱和變形菌綱類細(xì)菌，且藍(lán)藻細(xì)菌綱和γ-變形菌綱-弧菌微生物群到養(yǎng)殖后期數(shù)量顯著上升;對蝦腸道中的主要微生物群為γ-變形菌綱-弧菌，在養(yǎng)殖中期有顯著上升。

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