王思涵 楊 濤 張金柱 董 婕 寇志玲 車代弟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030）

玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）是薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）的落葉灌木，品種繁多，香氣馥郁，是園林綠化和水土保持的優(yōu)良植物材料［1］。玫瑰花果碩大飽滿，顏色鮮艷且產(chǎn)量高［2］，是重要的觀花和觀果花卉，具有很高的觀賞價值。玫瑰抗寒、抗病、耐干旱瘠薄，作為重要的防風(fēng)固沙植物棲息在濱海沿岸，不僅是薔薇屬花卉栽培繁育的重要種質(zhì)資源，還對于保持生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定具有重大作用［3］。20 世紀(jì)80 年代，由于資源過度的開發(fā)利用以及其本身種子品質(zhì)差及后熟的特性，野生玫瑰在中國的分布區(qū)逐漸縮小甚至出現(xiàn)了片斷化現(xiàn)象。1992 年，野生玫瑰作為國家二級保護(hù)植物被編入進(jìn)《中國植物紅皮書——稀有瀕危植物（第一冊）》中［4］。

吉林琿春分布區(qū)是國內(nèi)目前唯一野生玫瑰天然群落保存尚好的區(qū)域，其自然繁育以無性繁殖為主，種子萌發(fā)率低，傳播力弱。Anderson 研究指出野生玫瑰的成熟種胚被木質(zhì)堅硬的果皮包裹并保護(hù)［5］，其果皮的硬度和厚度是阻礙玫瑰種子發(fā)芽的主要障礙之一［6］。2015 年De Vries 研究發(fā)現(xiàn)薔薇屬植物成熟瘦果的果皮成熟初期含有高濃度的脫落酸，也阻止種子的直接萌發(fā)，致使新收獲的玫瑰種子便具有深度休眠的特性，嚴(yán)重制約著玫瑰資源的保護(hù)與利用［7］。然而，種子的休眠特性與果實的成熟過程密不可分［8］。Dubois［7］認(rèn)為果實成熟過程中顏色的變化可能指示種子休眠的深度。曾有育種者建議在玫瑰果實著色前提取瘦果，可以促進(jìn)早期發(fā)芽，并且認(rèn)為果實成熟的最后30 d種子才具有休眠狀態(tài)，然而這一系列猜想尚未有研究數(shù)據(jù)及成果支持。因此，本研究通過對野生玫瑰果實成熟過程中種子生長發(fā)育情況及種子內(nèi)源激素含量變化的掌握，探究果實發(fā)育過程中種子休眠性的變化，對野生玫瑰資源的保護(hù)利用及玫瑰的生產(chǎn)栽培管理具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為吉林省琿春市自然群落中的野生玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）。從2019 年7 月開始，從玫瑰開花當(dāng)天開始掛牌，于花后每隔1～3 d，隨機(jī)取生長勢相近的玫瑰果實3～5 個，裝于冰盒內(nèi)帶回實驗室進(jìn)行測定，直至果實成熟時結(jié)束。果實成熟標(biāo)志為：果實完全著為均勻的紅色，成扁圓形且富有光澤。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生玫瑰果實及種子生長時期的確定

隨機(jī)選取3～5 個發(fā)育狀態(tài)良好、大小相近的玫瑰果實進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照。每次取樣后用游標(biāo)卡尺對果實的縱徑、橫徑進(jìn)行測量。剝開果實取出100粒種子，使用游標(biāo)卡尺測量種子的最大長度、寬度，用千分之一天平測量種子的千粒重，3次重復(fù)。

1.2.2 種子發(fā)育的胚胎學(xué)觀察

參照高營營的石蠟切片制作方法［9］，種子采收后迅速放入FAA 固定液（70%酒精∶冰乙酸∶甲醛=90∶5∶5）中固定，以梯度乙醇溶液（70%，85%，95%）脫水后浸蠟包埋。將包埋好的蠟塊切成蠟帶置于載玻片上，并在37℃烘片機(jī)上展片。切片干燥脫蠟后，經(jīng)番紅與固綠染色，最后利用中性樹膠封片固定。制成的切片置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 野生玫瑰果實發(fā)育過程中內(nèi)果皮硬化觀察

玫瑰內(nèi)果皮質(zhì)地較硬，木質(zhì)化程度較高，通過間苯三酚法對木質(zhì)素染色，可以直觀地反映其內(nèi)果皮硬化的程度。本試驗選取玫瑰果實發(fā)育過程中的3 個時間點：花后24 d（青果期種胚發(fā)育完全）、花后50 d（轉(zhuǎn)色期）、花后75 d（紅果期）果實和種子進(jìn)行染色，染色方法參照韓國粉的制作方法［10］，染色反應(yīng)結(jié)束后將種子取出觀察并拍照記錄。

1.2.4 種子內(nèi)源激素含量變化測定

試驗材料選取不同發(fā)育時期的玫瑰果實，剝開后稱取質(zhì)量為0.3 g的玫瑰鮮種子置于液氮中保存，3次重復(fù)。GA3，IAA和ABA的提取及含量測定參考謝瑩（2014年）的方法［11］。

色譜條件：色譜柱采用Symmetry?C18 色譜柱，流動相為甲醇∶乙腈∶0.7%冰乙酸溶液=50∶5∶45 v/v/v，柱溫：25℃，流速：0.8 mL·min-1，紫外檢測波長：260 nm，進(jìn)樣量：20 μL。采取外標(biāo)工作曲線法定量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗測得數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行整理，并用Graphpad Primer 軟件獲得相關(guān)的折線圖或柱狀圖，應(yīng)用SPSS 20對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生玫瑰果實不同發(fā)育時期果實及種子質(zhì)量的變化

玫瑰的開花期為每年的7～9 月底，果期為8～10月。玫瑰開花后，受精的子房逐漸發(fā)育成瘦果，胚珠發(fā)育成種子。根據(jù)玫瑰果實發(fā)育不同時期的質(zhì)量指標(biāo)變化（見圖1A），可以看出，果實的生長過程可劃分為3 個時期，分別為青果期、轉(zhuǎn)色期和紅果期，其中青果期（1～35 d）也為果實的第Ⅰ速長期，其直徑和橫徑的增長較快，凈增長量占成熟時的53.88%和53.82%，此時果實成圓形，顏色為青綠色，果形指數(shù)為0.916±0.113；轉(zhuǎn)色期（35～60 d），也為果實的緩慢生長期，由于內(nèi)果皮的木質(zhì)化，玫瑰果實的直徑和橫徑增長緩慢，果實顏色由青綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌燃t色；紅果期（60～75 d），即第Ⅱ快速生長期，由于果實細(xì)胞的迅速膨大和后期營養(yǎng)物質(zhì)的積累，果實的直徑和橫徑增長速度變快，果實橫徑大于縱徑，果實呈扁球形，果形指數(shù)為0.771±0.052。果實發(fā)育成熟后顏色也轉(zhuǎn)變?yōu)槌燃t色。

不同發(fā)育階段的果實內(nèi)種子的大小及千粒重變化也有很大的不同。如圖1B～C 所示，在青果期（1～24 d）種子千粒重迅速增加，此時種子橫徑與直徑也不斷增長，說明種子發(fā)育較快，不斷膨大并富含水分。種子千粒重在24 d 達(dá)到頂峰，但種子體積還在不斷變大，說明24 d 時內(nèi)果皮開始木質(zhì)化逐漸失去水分，但種子內(nèi)含物還在積累，體積還在膨脹。在果實轉(zhuǎn)色期和紅果期種子橫縱徑不斷減小，千粒重也隨著果實的發(fā)育不斷變輕，伴隨著內(nèi)果皮木質(zhì)化的完成最終于75 d 時種子形態(tài)基本不再發(fā)生改變。

2.2 野生玫瑰果實不同發(fā)育時期果實與種子外部形態(tài)及胚胎發(fā)育的變化

如圖2可知，種子的胚胎發(fā)育是在青果期完成的。花后1 d 即形成合子，此時種子為透明的黃色?；ê? d，內(nèi)果皮顏色變?yōu)榘胪该鞯狞S色，富含水分，此時合子開始啟動分裂，形成多細(xì)胞原胚?；ê? d，種子體積持續(xù)增長，多細(xì)胞原胚持續(xù)分裂形成球形胚?；ê?2 d 時球形胚持續(xù)分裂，逐漸形成突起，當(dāng)球形胚體積增大和原表皮明顯出現(xiàn)后，周圍區(qū)的細(xì)胞分裂更加活躍，細(xì)胞分裂分布的變化預(yù)示著心形胚將開始?；ê?5 d，種子顏色變?yōu)椴煌该鞯狞S色，體積不斷增大。球形胚在頂端形成兩個突起的子葉原基，形成心形胚。心形胚發(fā)育時期，子葉將形成的區(qū)域細(xì)胞分裂增多，由于細(xì)胞分裂的不一致性和細(xì)胞的擴(kuò)大，胚在下胚軸區(qū)域會開始伸張而形成魚雷形。花后24 d，種子體積持續(xù)增大，質(zhì)地變硬，此時種胚已發(fā)育成完整的子葉胚。由于內(nèi)果皮木質(zhì)素的沉積，此時已難以形成完整切片?；ê?0～75 d，內(nèi)果皮開始變不透明黃色，最終硬化變成黃色的成熟種子。

2.3 野生玫瑰果實不同發(fā)育時期內(nèi)果皮發(fā)育及木質(zhì)素沉積的變化

2.3.1 不同發(fā)育時期內(nèi)果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化

玫瑰花后第6 天的果實內(nèi)果皮由7～9 層厚壁細(xì)胞組成，細(xì)胞小而密集且排列緊密，無明顯的胞間隙，與中果皮界線明顯（見圖3A～B）。果實發(fā)育到第15 天時內(nèi)果皮細(xì)胞分裂分化迅速，數(shù)目不斷增多，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)扁平狀，縱向延長。外側(cè)1～2層細(xì)胞呈方形緊密排列，內(nèi)側(cè)細(xì)胞均呈扁平狀緊密排列（見圖3C～D）。果實發(fā)育成熟后，內(nèi)果皮細(xì)胞細(xì)胞壁逐漸加厚，木質(zhì)化嚴(yán)重。最外側(cè)的1～2層細(xì)胞開始增厚，形成了木質(zhì)化的石細(xì)胞層，逐漸形成堅硬的種殼，石細(xì)胞層以內(nèi)的內(nèi)果皮細(xì)胞排列非常致密，幾乎無法用石蠟切片法進(jìn)行切片觀察（見圖3F）。

2.3.2 不同發(fā)育時期內(nèi)果皮木質(zhì)素沉積情況

圖4 顯示出了不同發(fā)育時期玫瑰果實和種子染色后體視顯微鏡下觀察的外觀特點。青果期時，果實內(nèi)導(dǎo)管組織含有一定木質(zhì)素，但此時內(nèi)果皮只發(fā)生了輕微染色，說明此時內(nèi)果皮中只有少量的木質(zhì)素沉積。果實轉(zhuǎn)色期時，肉眼已可看到內(nèi)果皮木質(zhì)化，且染色部位明顯擴(kuò)大，染色程度加深。果實成熟期，內(nèi)果皮已完全被染成深紅色，染色范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。

2.4 野生玫瑰果實發(fā)育過程中種子內(nèi)源激素含量的變化

2.4.1 玫瑰果實發(fā)育期種子內(nèi)源ABA 的含量變化

如圖5A 所示，種子內(nèi)源ABA 含量隨著果實的發(fā)育呈下降趨勢。種子內(nèi)源ABA含量在青果期時最高，達(dá)到196.85 μg·g-1。到轉(zhuǎn)色期則有一個明顯的下降，降幅達(dá)62.76%。轉(zhuǎn)色期和紅果期果實內(nèi)種子ABA含量基本持平。

2.4.2 玫瑰果實發(fā)育期種子內(nèi)源GA3含量變化

種子內(nèi)源GA3特征是含量高，變化大，整體呈下降趨勢（如圖5B）。青果期時種子快速發(fā)育，此時赤霉素含量最高，為10 522.9 μg·g-1。到了轉(zhuǎn)色期，赤霉素含量稍有下降。轉(zhuǎn)色期到紅果期種子內(nèi)源赤霉素含量急速下降，由9 364.03 μg·g-1下降為2 878.47 μg·g-1，降幅為69.26%。玫瑰種子發(fā)育過程中GA3含量的高峰出現(xiàn)在青果期，即種胚發(fā)育成熟期。說明GA3和種胚的生長存在密切的相關(guān)現(xiàn)象。

2.4.3 玫瑰果實發(fā)育期種子內(nèi)源IAA含量變化

種子內(nèi)源IAA 含量隨著果實的發(fā)育呈先上升后下降的趨勢。青果期時種子內(nèi)源IAA 含量較其他激素處于較低的水平，后隨著果實的發(fā)育整體呈現(xiàn)上升的變化趨勢。青果期至轉(zhuǎn)色期時，種子內(nèi)源IAA 含量變化幅度較大，由5.567 μg·g-1迅速升至32.879 μg·g-1，增幅高達(dá)83.07%。轉(zhuǎn)色期到紅果期IAA含量又下降至20.457 μg·g-1。

3 討論

3.1 野生玫瑰果實發(fā)育和種子發(fā)育的相關(guān)性

果實是種子在母株上的載體，種子會隨著果實的發(fā)育逐漸進(jìn)行胚分化及胚乳和種皮的形成，因此種子的形態(tài)、營養(yǎng)物質(zhì)的積累及內(nèi)源激素的調(diào)控都與果實的發(fā)育存在聯(lián)系和相互作用［12］。劉平［2］對8 個玫瑰品種的果實生長動態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，野生類型果實橫徑生長中有兩個生長較快時期，縱徑增長趨勢大體一致。本試驗將果實的生長發(fā)育期分為青果期（1～35 d）、轉(zhuǎn)色期（35～60 d）、紅果期（60～75 d）三個時期，生長速度呈現(xiàn)“快—慢—快”的變化趨勢。青果期時種子含水量最高，外觀形態(tài)不斷膨大，重量迅速提升。轉(zhuǎn)色期果實內(nèi)果皮木質(zhì)化脫水，種子外表面顏色加深，種子體積變小，千粒重開始變輕。紅果期種子形態(tài)已基本保持穩(wěn)定。研究結(jié)果與油茶果實及種子的生長動態(tài)相類似［13］。

有研究認(rèn)為玫瑰中花粉管到達(dá)子房所需的時間估計在授粉后12～24 h，且發(fā)育速度快［14］。2017年付長麗［15］通過內(nèi)源激素含量證明牟平玫瑰種胚在授粉60 d 已經(jīng)發(fā)育成熟，但該結(jié)果未結(jié)合胚胎學(xué)觀察，因此范圍較廣，不能確定最初成熟的時間。本試驗結(jié)合石蠟切片技術(shù)觀察到玫瑰花后1 d形成合子，花后3 d 發(fā)育為多細(xì)胞原胚，花后24 d玫瑰種胚發(fā)育完全，結(jié)果與Luca Pipino 認(rèn)為多花玫瑰種胚30 d 發(fā)育完全的試驗結(jié)果相類似［8］。本試驗結(jié)果證明了野生玫瑰種子在果實的青果期便已發(fā)育完全，具有完整的胚結(jié)構(gòu)，即野生玫瑰種子不存在形態(tài)休眠。

3.2 野生玫瑰種子組織結(jié)構(gòu)發(fā)育對其休眠性形成的影響

內(nèi)果皮具有重要的作用價值，它對種胚起到天然的保護(hù)作用［16］。內(nèi)果皮細(xì)胞的發(fā)育是一個逐漸木質(zhì)化的過程［17～18］，然而木質(zhì)化嚴(yán)重的內(nèi)果皮會制約玫瑰種子的繁殖能力，有性繁殖能力差成為野生玫瑰資源衰減的重要原因之一。研究結(jié)果證明，內(nèi)果皮開始硬化的時間為24 d，此時種胚已發(fā)育完全，內(nèi)果皮細(xì)胞壁逐漸加厚并失水皺縮，種子千粒重開始下降，間苯三酚染色觀察到此時已有少量木質(zhì)素沉積。果實轉(zhuǎn)色期（35～60 d）時，種子質(zhì)量變小，內(nèi)果皮木質(zhì)化程度持續(xù)加深。到了紅果期（60～75 d）時內(nèi)果皮基本已完全木質(zhì)化，種子外觀形成了一層厚重的“殼”，結(jié)構(gòu)致密難以剝離，此時內(nèi)果皮對種子的萌發(fā)起到了嚴(yán)重的阻礙作用，種子已進(jìn)入機(jī)械休眠［19］。

3.3 野生玫瑰果實發(fā)育中種子內(nèi)源激素的變化對其休眠性形成的影響

張妮妮認(rèn)為不同的果實成熟度對玫瑰種子萌發(fā)影響較大［20］。而果實的成熟與激素含量變化有關(guān)，其生長依賴于發(fā)育正常的種子，種子又是激素合成的主要場所［21］。通常，種子內(nèi)產(chǎn)生植物激素向外擴(kuò)散，刺激周圍組織生長，并調(diào)控著果實的發(fā)育周期［22］。2020 年高美玲［23］研究發(fā)現(xiàn)高濃度的ABA 在西瓜種子生長過程中起到促進(jìn)發(fā)育的作用。本試驗中，ABA 對種子的調(diào)控高峰在果實的青果期，此時果實發(fā)育迅速，生長力旺盛，ABA 的濃度最高，這也與樊衛(wèi)國［24］發(fā)現(xiàn)在刺梨種子發(fā)育前期，高濃度的ABA 與促進(jìn)代謝和細(xì)胞分裂有關(guān)的結(jié)論一致。種子內(nèi)源ABA含量與果實顏色轉(zhuǎn)化密切相關(guān)［25］。研究認(rèn)為，果實轉(zhuǎn)色期前內(nèi)源ABA含量較高，進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后，為了利于果肉內(nèi)番茄紅素和β-胡蘿卜素的積累，ABA 含量迅速下降［26］。本試驗也得到了相似的實驗結(jié)果，即果實轉(zhuǎn)色期種子內(nèi)源ABA 含量降低，降幅高達(dá)62.76%。種子內(nèi)高濃度的脫落酸含量似乎是玫瑰種子生理休眠的主要原因。

果實成熟前種子內(nèi)赤霉素含量的上升與胚發(fā)育相關(guān)［27］。付長麗［15］研究發(fā)現(xiàn)授粉30 d 后的玫瑰種胚中的GA3含量隨著發(fā)育時間逐漸降低。本研究結(jié)果與其相一致，并觀察了種胚形成期的赤霉素濃度。在本研究中，青果期（1～35 d）果實內(nèi)種胚正處于發(fā)育時期，細(xì)胞不斷分裂分化形成成熟胚，此時種子內(nèi)源GA3含量最高，隨著果實生長速度變緩，種子發(fā)育完全成熟，進(jìn)入轉(zhuǎn)色期和紅果期GA3合成能力下降，含量減少。

種子內(nèi)IAA 含量在果實青果期到轉(zhuǎn)色期有顯著變化，此時正是內(nèi)果皮逐漸木質(zhì)化的過程，而木質(zhì)素的沉積與激素含量之間具有密切的關(guān)系［28～29］。Biale 研究認(rèn)為果實的成熟與IAA 密不可分，一些果實內(nèi)源IAA 必須先經(jīng)氧化，使其濃度降低后果實才能完熟［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，青果期到轉(zhuǎn)色期時種子內(nèi)源IAA 含量增加。轉(zhuǎn)色期到紅果期，種子中IAA 含量又開始降低直至果實完全成熟。由此推斷內(nèi)果皮發(fā)育及果實的成熟與生長素間存在一定的關(guān)系，而生長素是如何調(diào)控或影響其發(fā)育過程的，目前還沒有直接的試驗證據(jù)，需要進(jìn)一步深入的研究。

本文通過形態(tài)學(xué)、組織細(xì)胞學(xué)觀察及高效液相色譜技術(shù)對果實發(fā)育期種子休眠性的形成及變化進(jìn)行了評價，并結(jié)合試驗數(shù)據(jù)得出結(jié)論：玫瑰果實發(fā)育過程中種胚發(fā)育完全，種子不具有形態(tài)休眠。種胚發(fā)育完全后內(nèi)果皮形成木質(zhì)素逐漸木質(zhì)化，使得種胚受到機(jī)械束縛產(chǎn)生種殼休眠。果實發(fā)育過程中種子體內(nèi)高濃度的ABA含量使得種子尚未脫離果實時便已進(jìn)入了生理休眠狀態(tài)。證明了尚未脫離果實的玫瑰種子具有生理休眠和種殼休眠兩種復(fù)雜的休眠性狀，這為日后深入探索玫瑰種子發(fā)育及休眠的分子調(diào)控機(jī)理提供數(shù)據(jù)信息。