段義忠 王海濤 張格格 嚴偉娜

（榆林學院，陜西省陜北生態(tài)修復重點實驗室，榆林 719000）

四合木（Tetraena mongolica）屬蒺藜科（Zygophyllaceae），是古地中海第三紀活化石植物，國家一級保護植物。四合木屬于落葉小灌木，雙數(shù)羽狀復葉，花1～2 朵著生于短枝上，成熟果實具有不開裂的分果瓣4 個，其種子形狀為鐮狀披針形，絕大多數(shù)果實中只含有一個較小的種子［1］。目前四合木（T.mongolica）在全世界分布區(qū)主要集中在中國內(nèi)蒙古鄂爾多斯、烏海、寧夏石嘴山等地，在俄羅斯、烏克蘭也有零星分布，為典型的西鄂爾多斯特有單種屬和特有群系，對維持中國西北干旱、半干旱區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)功能及穩(wěn)定性具有重要意義。四合木具有超強抗旱能力，但近年來由于全球氣候變化的加劇以及人類對其分布區(qū)域所屬地區(qū)的煤炭等天然礦產(chǎn)資源的大量開采等對生態(tài)環(huán)境的干擾［2～3］，使得四合木這一瀕危物種所在分布區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)變得非常脆弱且分布面積迅速縮小，其棲息地僅為2 700 km2，且呈現(xiàn)破碎化分布，生境適宜性驟降，瀕危狀況加?。?］。

當前國內(nèi)外針對四合木的研究主要集中在其光和特征及固碳能力［5～6］、保護對策［7］、花粉形態(tài)學［8］、種子脂肪酸含量測定及分析［9］、傳粉生態(tài)學［10］、生理學和瀕危肇因與機制等方面［11～12］。依據(jù)四合木在異域播種后生長量大小比較及對不同屬性土壤和對水、熱等綜合影響因子的適應性分析得到，相同地區(qū)不同土壤間四合木生長量之間不存在差異性，不同地區(qū)相同土壤間四合木生長量之間卻存在著特別明顯的差異性，表明了土壤條件對四合木的生長影響不大，而氣候成為直接影響四合木生長的最重要條件；四合木分布區(qū)與異地保護區(qū)中土壤之間的微量元素具有一定的差異性，但因為土壤中的微量元素含量均低于植物中含量，表明四合木具有對土壤中微量元素的富集作用，土壤中微量元素的含量并不能影響四合木正常生長［13］。張云飛等［14］通過設(shè)計了9個10 m×10 m 樣方的觀察結(jié)果，系統(tǒng)地對比了四合木在自然更新、消極圍欄保護和積極圍欄保護3種不同情況下的種群生長狀況，結(jié)果表明消極圍欄保護對四合木種群的更新?lián)Q代并無促進作用；而積極進行圍欄保護也就是人工圍欄并進行適當?shù)难a水補肥對四合木種群有很好的保護作用，是就地保護四合木的有效手段。Ge 等［15］對四合木基因的變異、種群結(jié)構(gòu)和譜系地理等方面進行評估，為四合木保護和管理提供依據(jù)。張穎娟和盧萍［16］對四合木進行了遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化、基因變異性和遺傳多樣性的研究，提出了應對具有較高遺傳多樣性的四合木中的meta-種群加強保護。近年來，諸多學者利用等位酶、RAPD和微衛(wèi)星等方法對四合木的遺傳多樣性和遺產(chǎn)結(jié)構(gòu)進行了研究［16～18］，但等位酶分析法所選酶的所有基因未必都能表達在酶譜上，且受酶數(shù)量影響，數(shù)量較少時，其結(jié)果可能不具有代表性［19］，而且RAPD 具有對反應條件敏感，重復性差，多態(tài)性信息量較低等不足［20］，增加了試驗難度和工作量。目前，還未見基于ISSR技術(shù)對四合木的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析研究。

ISSR（Inter-simple sequence repeat）即簡單重復序列標記，其基本原理為將1～4 個堿基作引物標定在SSR 的3'或5'端，擴增兩側(cè)具有反向排列SSR 的一段序列，而不是擴增SSR 本身［21］。ISSR分子標記技術(shù)同時具有多種分子標記的優(yōu)點，ISSR 成本低且多態(tài)性高、可獲得幾倍于RAPD 的信息量、精確度高、有較高的重復性且相對穩(wěn)定、簡單快捷且更容易操作、更專一。物種經(jīng)歷長時間的進化而具有了豐富的遺傳多樣性，這對研究物種的生物學特性具有重要意義，通過對物種遺傳多樣性的研究可以得知該物種的適應性、生存力，進而對其實施科學有效保護措施。ISSR 分子標記技術(shù)同時兼具多種分子標記技術(shù)的優(yōu)點，因此該技術(shù)得到了各界的肯定并得到了廣泛應用［22］。李娟等［23］利用ISSR分子標記對閩楠不同地理種群的遺傳多樣性進行分析，研究結(jié)果為該物種保護策略制定提供有價值的種群遺傳學信息。沈奇等［24］采用ISSR 分子標記技術(shù)對野生桃兒七13 個居群進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明種群內(nèi)的基因流十分豐富，居群內(nèi)的遺傳分化明顯大于居群間的分化，聚類結(jié)果顯示桃兒七13 個居群可以分為兩大類，研究結(jié)果為其品種分類及種質(zhì)保護提供理論依據(jù)。

本試驗以中國西北干旱區(qū)特有孑遺瀕危植物四合木為研究對象，選取鄂爾多斯高原西部6個不同地理分布的四合木種群作作為試驗材料，利用ISSR 分子標記技術(shù)進行試驗，通過分析和探討其遺傳多樣性水平及遺傳結(jié)構(gòu)，以解釋其遺傳多樣性與不同地區(qū)的生境條件關(guān)系，為四合木遺傳資源的有效保護、管理與利用提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗所采集的四合木種群材料均來自中國四合木自然棲息地6 個自然種群（見表1），采下嫩葉置于自封袋并放入適量變色硅膠，記錄后放于-80℃的超低溫冰箱中作為試驗材料。

表1 四合木采樣地點Table 1 Sampling position of T.mongolica

1.2 DNA的提取及檢測

采用三博遠志公司提供的DNA提取試劑盒提取，將提取好的DNA 溶液稀釋10 倍后，將其保存于-20℃的冷藏環(huán)境中備用。將上述試驗提取出來的四合木DNA 挑選出一組作為模板，選取30 條UBC引物進行擴增。從中篩選出6個清晰度較好、條帶數(shù)目多且沒有拖尾現(xiàn)象的引物，將以下6 個UBC引物作為下一步擴增的引物（見表2）。

表2 UBC引物序列Table 2 UBS primer sequence

本試驗采用了單因素法對25 μL 的PCR 反應體系各項因子進行優(yōu)化。以UBC 811 和UBC 835為引物，參考相關(guān)文獻設(shè)計了4 個10×Easy Tag buffer梯度：1.5，2.0，2.5和3.0 μL；4個dNTPs梯度：1.6，2.0，2.4 和2.8 μL；4 個Easy Taq DNA 聚合酶梯度：0.10，0.15，0.20 和0.25 μL；DNA（母液稀釋10倍）模板設(shè)計4 個梯度1，2，3 和4 μL。最后得出PCR 反應體系為：DNA 模板2 μL，UBC 引物1 μL，Taq 聚合酶0.15 μL，dNTP 1.6 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 17.75 μL。對退火溫度、循環(huán)次數(shù)及延伸時間進行優(yōu)化后的PCR擴增程序為：①選擇94℃預變性5 min；②變性30s 后在42℃～48℃溫度下退火30 s；③在72℃溫度下延伸3 min，循環(huán)32次，再補平7 min；④選擇8℃溫度下永久保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

通過人工識別的手段記錄四合木66個材料的凝膠電泳圖譜條帶數(shù)目。由于ISSR分子標記是顯性標記，所以一個引物的結(jié)合位點用電泳圖譜中的每個清晰的條帶表示。對于同一引物，條帶電泳遷移率一致說明是具有同源性的擴增產(chǎn)物。篩選上述凝膠電泳圖中易于辨認且較為清晰的條帶，將同一位置上是否有DNA 結(jié)合位點的條帶進行統(tǒng)計。統(tǒng)計的結(jié)果以二元數(shù)據(jù)的形式記錄，穩(wěn)定出現(xiàn)的清晰條帶（顯性）記作1，沒有條帶（隱性）記為0，制作“0.l”組成的原始矩陣并記錄數(shù)據(jù)。利用軟件Popgene 32 計算“0，1 矩陣”多態(tài)位點、多態(tài)位點百分率、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（He）、Shannon’s信息指數(shù)以及Nei的遺傳距離等參數(shù)。用分析軟件NTSYS-PC對統(tǒng)計結(jié)果進行聚類分析，得到四合木種群間的遺傳聚類圖，以此來研究四合木6個不同地理種群的親緣關(guān)系和遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR擴增結(jié)果

本試驗利用6個ISSR引物（UBC810，UBC811，UBC814，UBC824，UBC835，UBC873）對6個不同地理種群的66個四合木個體進行ISSR-PCR 擴增，引物UBC811對千里溝、伊克布拉格、甘德爾山、四合木自然保護區(qū)、磴口—桃司兔和巴拉貢的24 個個體DNA模板擴增后電泳得到的電泳圖（見圖1）。

2.2 各個引物擴增產(chǎn)物的多態(tài)性

本試驗選擇用6 個ISSR 引物對6 個不同地理種群的四合木進行ISSR-PCR 擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳共獲得370 個清晰的電泳譜帶，利用POPGENE 1.31 軟件分析四合木各種群的遺傳多樣性指數(shù)［25］。結(jié)果顯示不同ISSR引物的差異存在于擴增帶數(shù)量、擴增帶型、多態(tài)性檢出率、條帶分布均勻度等多方面。試驗所用的6條引物，各自的擴增結(jié)果于不同材料間表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，在一定程度上表明四合木遺傳背景的復雜性與豐富的遺傳多樣性。四合木的各引物擴增多態(tài)性結(jié)果參照ISSR引物擴增結(jié)果（見表3）。

2.3 蒙古沙冬青不同地理種群的遺傳多樣性

用Popgene 32 軟件計算四合木各種群的各項相關(guān)指數(shù)［26］。計算結(jié)果參照四合木遺傳多樣性（見表4），不同種群的四合木平均多態(tài)位點數(shù)為23，Nei’s 多樣性指數(shù)（He）為0.286 5～0.350 8，Shannon’s 信息指數(shù)（I）為0.423 6～0.504 9，其四合木自然保護區(qū)的Nei’s多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)均為6個地理種群中最高，而磴口桃司兔的Nei’s 多 樣 性 指 數(shù) 和Shannon’s 信 息 指 數(shù) 均 為最低。

表3 ISSR引物擴增結(jié)果Table 3 ISSR primer amplification results

2.4 四合木不同地理種群遺傳多樣性及遺傳距離分析

利用軟件Popgene 32 軟件計算四合木不同地理種群的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.125 3，表明群體間存在一定程度的遺傳分化；種群內(nèi)遺傳多樣性（Hs）為0.316 7，表明四合木的遺傳分化主要發(fā)生在種群內(nèi)；6 個種群的基因流（Nm）為3.491 5＞1，表明四合木6個種群間具有一定的基因流，可以防止遺傳漂變所導致的遺傳分化。由四合木種群間的遺傳距離結(jié)果可知，伊克布拉格種群（YKBLG）和巴拉貢種群（BLG）的遺傳距離最小為0.025 9，而四合木千里溝種群（QLG）和甘德爾山種群（GDES）遺傳距離最大為0.974 4（見表5）。

2.5 四合木不同種群聚類分析

用NTSYS.pc 2.10e 軟件構(gòu)建了四合木6 個種群的聚類分析圖（見圖2），6 個種群聚類結(jié)果被聚為三大類，千里溝種群、伊克布拉格種群和巴拉貢種群先聚成第一大類，再與磴口—桃司兔種群聚成第二大類，而種群四合木自然保護區(qū)種群和種群甘德爾山種群則組成第三大類。

表4 基于ISSR標記的四合木遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of T.mongolica based on ISSR marker

表5 四合木種群間的遺傳距離Table 5 Genetic distance between T.monglica populations

3 討論

遺傳多樣性一般指物種種內(nèi)的遺傳多樣性，即同一物種不同群體間或是同一種群內(nèi)的不同個體的遺傳變異總和。一個物種的遺傳多樣性與其適應環(huán)境變化的能力呈正相關(guān)，遺傳多樣性越高其對環(huán)境的適應能力越強［27］。四合木作為一種特有建群植物，其長期處在土壤貧瘠、氣候干燥的惡劣環(huán)境中且不斷繁衍、進化，因此展現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。6 個地理種群中，Nei’s 多樣性指數(shù)（He）、Shannon’s信息指數(shù)（I）最高的均是四合木自然保護區(qū)種群，該地區(qū)年均溫度相對其他幾個地區(qū)偏高，且滿足四合木生長所需要的水分，這些條件是導致四合木具有豐富的遺傳多樣性的基礎(chǔ)，而桃司兔因其特殊的地理位置，相對較低的溫度和相對濕潤的氣候，使得該地區(qū)四合木種群的遺傳多樣性較低。和其余種群相比，四合木自然保護區(qū)種群的遺傳多樣性更顯著，對其周邊的四合木種群應首先加強保護，但是只保護該地區(qū)的四合木種群對四合木整體的遺傳多樣性的保護是不利的，所以應當制定合適的遷地保護策略?；蛄骷瓷锓N群之間的基因交流，當某一物種的基因流大于5.0 時，說明該物種具有較高的異交率，而當基因流（Nm）小于l時，遺傳漂變導致了種群間的遺傳分化。植物種群內(nèi)和種群間的基因流主要依賴于孢子、花粉、種子、植株個體以及其他攜有遺傳物質(zhì)的物體等媒介進行，花粉傳播和種子擴散是自然植物種群最主要的基因流的方式［18］。適當?shù)幕蛄鞑坏梢跃S持種群的穩(wěn)定性，而且在一定程度上可以提高它們對不斷變化的環(huán)境適應能力。四合木基因流Nm為3.491 5，Nm＞1.0，說明四合木種群間基因流水平較高。四合木6 個種群的平均遺傳距離為0.139 3，說明四合木種群之間的遺傳分化程度較小。通過四合木種群間的聚類圖可知聚類結(jié)果分為三類，種群千里溝、伊克布拉格和巴拉貢先聚成一大類，再與甘德爾山聚成第二大類，而四合木自然保護區(qū)和桃司兔則組成第三大類。這說明距離因素是影響四合木種群間遺傳分化的主要原因，但不同生境條件也對四合木種群的遺傳分化產(chǎn)生了影響，桃司兔與千里溝、伊克布拉格和巴拉貢因距離較近，但也產(chǎn)生了一定的遺傳分化，主要原因是因為桃司兔的生境條件為黃河河灘生境，相對濕度較大；而千里溝、伊克布拉格和巴拉貢為荒漠草原生境，相對濕度較小，生境的差異導致了桃司兔種群與另外的三個種群產(chǎn)生了遺傳差異。因此，本研究的結(jié)果對于進一步研究四合木的遺傳分化是否與地理因素相關(guān)具有一定的參考意義。張穎娟等［28］利用等位酶和RAPD分析技術(shù)對海南區(qū)、桃司圖、烏加廟、石嘴山和千里山的四合木種群進行遺傳距離分析結(jié)果表明，烏加廟種群與其他4 個種群的遺傳距離都較大，并認為是生境的選擇壓力所導致而與距離因素無關(guān)，與本研究的結(jié)果不一致，主要原因可能是RAPD 與ISSR 算法原理上的不同，雖然ISSR 與RAPD 兩種研究方法在一定程度上都能反映四合木的遺傳多樣性較高，但RAPD 在方法上有一定缺陷，而ISSR多態(tài)性、精確度和重復性都較高，

通過對四合木6 個不同地理種群進行研究得出如下結(jié)論：①本試驗共篩選出6 條ISSR 引物獲得多樣性豐富、清晰的條帶共370 個，其中261 個條帶具有多態(tài)性，占總條帶數(shù)的71%，6 個地理種群中四合木自然保護區(qū)種群的Nei’s多樣性指數(shù)、Shannon’s 信息指數(shù)均為最高，而磴口—桃司兔的則為最低。以上結(jié)果表明本試驗的四合木遺傳多樣性水平較高，且本研究所采集的66 個樣本分布范圍較廣，生態(tài)環(huán)境差異較大，其所處植物群落結(jié)構(gòu)差異較大，所以具有豐富的遺傳多樣性。②通過對四合木6個種群的基因分化系數(shù)（Gst）分析，表明種群內(nèi)遺傳多樣性變異的百分率為81.81%，說明種群內(nèi)變異是四合木的遺傳變異主要來源。種群內(nèi)遺傳多樣性（Hs）為0.316 7，說明四合木的遺傳分化主要發(fā)生在種群內(nèi)。6 個種群的基因流（Nm）為3.491 5＞1，表明6 個種群間具有一定的基因流，可以防止遺傳漂變所導致的遺傳分化。四合木的6 個種群的遺傳距離平均值為0.139 3，伊克布拉格種群和巴拉貢種群的遺傳距離最小為0.025 9，而千里溝種群和甘德爾山種群遺傳距離最大為0.974 4。由四合木種群間的聚類圖得知聚類結(jié)果分為三類：千里溝種群、伊克布拉格種群和巴拉貢種群先聚成一大類，再與磴口—桃司兔種群聚成第二大類，而四合木自然保護區(qū)種群和甘德爾山種群則組成第三大類。這說明距離因素是影響四合木種群間遺傳分化的主要原因，但不同生境條件也對四合木種群的遺傳分化產(chǎn)生了影響。