馬鳴宇, 劉思航, 陳圣福

絲素蛋白微纖維增強(qiáng)的高強(qiáng)度雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠

馬鳴宇, 劉思航, 陳圣福

(1. 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310027)

為了解決傳統(tǒng)水凝膠材料力學(xué)性能偏弱，無法滿足組織工程中對于植入材料強(qiáng)度和抗疲勞性能的要求，提出一種將絲素蛋白微絲作為交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)與線性親水性聚合物相結(jié)合的強(qiáng)化思路。絲素蛋白(SF)是一種具有良好生物相容性的天然蛋白質(zhì)，由物理交聯(lián)的微絲具有良好的機(jī)械性能，可以作為一種理想的強(qiáng)化材料。將絲素蛋白微絲作為交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)與線性親水性聚合物相結(jié)合，通過一鍋法分別合成甲基丙烯酸羥乙酯/絲素蛋白(HEMA/SF)和甲基丙烯酰胺/絲素蛋白(MAA/SF) 2種高強(qiáng)度物理交聯(lián)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。經(jīng)過壓縮和拉伸等力學(xué)性能的表征，結(jié)果表明，強(qiáng)化后的水凝膠在強(qiáng)度上提升了5~10倍，彈性模量和能量吸收也提升了一個(gè)數(shù)量級以上，相比已有雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠有更優(yōu)秀的韌性和結(jié)構(gòu)可恢復(fù)能力。

高強(qiáng)度水凝膠；絲素蛋白；雙網(wǎng)絡(luò)；物理交聯(lián)；力學(xué)性能

1 前 言

絲素蛋白(silk fibroin，SF)是一種提取于天然蠶絲的蛋白質(zhì)，形成的微絲具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，兼具良好的機(jī)械性能和生物相容性。絲素蛋白最早被應(yīng)用于手術(shù)縫合線中[1-2]，如今越來越多的絲素蛋白衍生物如薄膜、支架、纖維和水凝膠等正廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和組織工程[3-5]。Zhou等[6]和Thierry等[7]分別通過鳥槍法和拉曼光譜等技術(shù)對絲素蛋白分子的氨基酸序列與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。絲素蛋白在組成上含有18種氨基酸，其中含有大量的甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和絲氨酸(Ser)，這3種氨基酸約占總氨基酸含量的80%以上。絲素蛋白重鏈的分子鏈上有大量GAGAGS重復(fù)結(jié)構(gòu)單元，這些重復(fù)單元在一定條件下能形成排列緊密、結(jié)構(gòu)高度有序的氫鍵締合折疊結(jié)晶區(qū)，通過X射線衍射已確定其屬于單斜晶系[8-9]。該結(jié)晶區(qū)相對較硬和較高的疏水性，使絲素蛋白形成的微絲在水環(huán)境中具有很高的機(jī)械強(qiáng)度，但缺乏柔韌性和延伸能力。溫度、pH、溶劑和應(yīng)力等的變化都能夠使絲素蛋白的無規(guī)則卷曲和螺旋向熱力學(xué)更穩(wěn)定的折疊轉(zhuǎn)變，形成微絲[10-14]。

雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(double network hydrogel)是一種經(jīng)典的水凝膠強(qiáng)化方式，是一種剛性-柔性雙網(wǎng)絡(luò)互穿的形式強(qiáng)化水凝膠。當(dāng)承受載荷時(shí)，剛性網(wǎng)絡(luò)通過犧牲鍵的形式對機(jī)械能進(jìn)行耗散，由第2網(wǎng)絡(luò)維持水凝膠的結(jié)構(gòu)完整性，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠能夠在超過90% 含水率同時(shí)獲得高彈性模量和應(yīng)力。然而這種水凝膠在壓縮后犧牲了其化學(xué)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，回復(fù)性能及抗疲勞性能仍有待提升[15-20]。為了解決傳統(tǒng)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的化學(xué)交聯(lián)不可逆破壞問題，改善水凝膠的恢復(fù)性能與抗疲勞性，基于化學(xué)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和具備多點(diǎn)弱相互作用聚合物形成的互穿的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠展現(xiàn)出了更大的研究價(jià)值[21-24]。Chen等[25]基于雙網(wǎng)絡(luò)理論使用“一鍋法”制備出聚丙烯酰胺/大分子瓊脂糖(PAM/Agar)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，其中第1網(wǎng)絡(luò)采用化學(xué)交聯(lián)的聚丙烯酰胺，而第2網(wǎng)絡(luò)則使用多氫鍵交聯(lián)的大分子瓊脂糖。這種物理與化學(xué)交聯(lián)結(jié)合的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在未經(jīng)水溶脹條件下，壓縮強(qiáng)度達(dá)到38 MPa，拉伸強(qiáng)度達(dá)到1 MPa，同時(shí)其可恢復(fù)性能也大大增強(qiáng)。

本文選用兼具出色機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性的絲素蛋白作為物理交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，以甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)或甲基丙烯酰胺(MAA)作為柔性網(wǎng)絡(luò)，通過原位聚合制備了完全由物理交聯(lián)所構(gòu)建的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，展示了高形變和抗疲勞能力，以及在高應(yīng)變條件下的高模量和高應(yīng)力響應(yīng)。結(jié)合結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，提出了絲素蛋白微纖維網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)化雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)以及甲基丙烯酰胺(MAA)均購于阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；過硫酸銨購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；可溶性凍干絲素蛋白購于蘇州絲美特有限公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子分析天平(CPA225D，賽多斯科學(xué)儀器有限公司)，即熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，鞏義市予華儀器有限公司)，旋渦混合器(FK-X1，方科儀器有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9053A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，微型高速離心機(jī)(Mini-14K，杭州奧盛儀器有限公司)，超聲波清洗機(jī)(YM-040S，深圳市方奧微電子有限公司)，萬能材料試驗(yàn)機(jī)(Zwick/Roell Z020，德國Zwick公司)，場發(fā)射掃描電子顯微鏡((SU8010，日本Hitachi有限公司)。

2.3 制備過程

HEMA/SF雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠制備過程：分別取質(zhì)量為0.2、0.3、0.4 g可溶性凍干絲素蛋白置于5 mL離心管中，加1 mL去離子水，置于旋渦混合器上充分震蕩后進(jìn)行超聲處理5 min，重復(fù)2~3次直至離心管中無固體殘留物。吸取質(zhì)量為0.5 g HEMA加入溶液中，再次置于旋渦混合器上充分震蕩后超聲處理，重復(fù)直至無固體殘留。將所得黏稠溶液分裝于2 mL離心管內(nèi)，以轉(zhuǎn)速10 000 r×min-1離心5 min之后得到淡黃色澄清黏稠溶液，再稱取HEMA摩爾分?jǐn)?shù)為1% 的過硫酸銨加入溶液充分混合均勻。最后向溶液中加入100 μL乙醇，混合均勻后將所得溶液注入模具中，置于80 ℃恒溫箱中過夜。在去離子水中平衡溶脹7 d后所得的不同濃度絲素蛋白的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠根據(jù)絲素蛋白的質(zhì)量濃度(g×mL-1)不同分別記為HEMA/SF-0.1、HEMA/SF-0.15、HEMA/SF-0.2。

MAA/SF雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠制備過程：分別取質(zhì)量為0.2、0.3、0.4 g可溶性凍干絲素蛋白置于5 mL離心管中，加1 mL去離子水，置于旋渦混合器上充分震蕩后進(jìn)行超聲處理5 min，重復(fù)2~3次直至離心管中無固體殘留物。稱取質(zhì)量為0.6 g MAA加入溶液中，將溶液加熱至75 ℃同時(shí)超聲處理，使MAA充分溶解。將所得黏稠溶液分裝于2 mL離心管內(nèi)，以轉(zhuǎn)速10 000 r×min-1離心5 min之后得到淡黃色澄清黏稠溶液，加入MAA摩爾分?jǐn)?shù)為1% 的過硫酸銨充分混合，處理過程中溶液應(yīng)保持至少60 ℃，否則溫度過低，MAA溶解度下降會從溶液中析出。最后向溶液中加入100 μL乙醇，混合均勻后將所得溶液注入模具中置于80 ℃環(huán)境放置過夜。在去離子水中平衡溶脹7 d后所得不同濃度絲素蛋白的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠根據(jù)絲素蛋白的質(zhì)量濃度(g×mL-1)不同分別記為MAA/SF-0.1、MAA/SF-0.15、MAA/SF-0.2。

HEMA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠制備過程：吸取質(zhì)量為0.5 g HEMA于2 mL離心管中，加入1 mL去離子水，充分混合后，加入HEMA摩爾分?jǐn)?shù)為1% 的過硫酸銨，置于80 ℃條件下2 h，所得水凝膠放入去離子水環(huán)境中進(jìn)行一周平衡溶脹。

MAA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠制備過程：稱取質(zhì)量為0.6 g MAA于2 mL離心管中，加入1 mL去離子水，充分混合后將溶液加熱至75 ℃同時(shí)超聲處理，使MAA充分溶解，加入MAA摩爾分?jǐn)?shù)為1% 的過硫酸銨后置于80 ℃條件下2 h，所得水凝膠放入去離子水環(huán)境中進(jìn)行一周平衡溶脹。

2.4 平衡含水率測定

制備完成后的水凝膠保存在去離子水中進(jìn)行至少一周的平衡溶脹。分別取若干溶脹平衡后的水凝膠樣品，用天平稱其質(zhì)量0。接著將樣品浸入液氮中冷凍，待樣品完全固化后置于冷凍干燥機(jī)中2 d。待樣品完全干燥后稱取殘余固體質(zhì)量1，平衡含水率為

=(0-1)/0×100% (1)

2.5 力學(xué)性能測試

2.5.1 壓縮測試

水凝膠被做成直徑10 mm，高10 mm的圓柱形樣品，使用萬能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行壓縮測試，測試速度為2 mm×min-1，形變量上限為95%。壓縮應(yīng)變能由應(yīng)力應(yīng)變曲線積分得到

式中：1為單位體積壓縮應(yīng)變能，MJ×m-3；為應(yīng)力，Pa；為應(yīng)變。

2.5.2 拉伸測試

水凝膠被做成厚度為1 mm啞鈴形片狀試樣，中間部分測試的有效長度為15 mm，寬度為4 mm。使用萬能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行拉伸測試，測試速度為6 mm×min-1。拉伸斷裂能為

式中：2為單位截面積拉伸斷裂能，MJ×m-2；為試樣長度，m；1為斷裂應(yīng)變值。

2.5.3 疲勞測試

水凝膠被做成直徑10 mm，高10 mm的圓柱形樣品，使用萬能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行壓縮循環(huán)測試，測試速度為2 mm×min-1，形變量上限分別為60%和90%，循環(huán)次數(shù)為5次。

2.6 水凝膠結(jié)構(gòu)分析

水凝膠經(jīng)溶脹平衡后置入液氮中快速冷卻，后放入冷凍干燥器中，3 d后取出完全干燥的樣品，打碎，取完整的斷面置于掃描電子顯微鏡下觀察其斷面形貌。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 平衡含水率

如圖1所示為HEMA/SF與MAA/SF體系的平衡含水率。經(jīng)過絲素蛋白強(qiáng)化后，HEMA/SF和MAA/SF水凝膠的含水率相比于單網(wǎng)絡(luò)的HEMA和MAA都有明顯的下降。隨著絲素蛋白質(zhì)量濃度的增加，SF強(qiáng)化水凝膠的含水率趨于平緩，絲素蛋白網(wǎng)絡(luò)有效抑制了水凝膠的溶脹，說明隨著絲素蛋白網(wǎng)絡(luò)的絲素含量的增加，其網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性逐漸提高。

圖1 HEMA/SF與MAA/SF體系的平衡含水率

3.2 壓縮性能

HEMA/SF與MAA/SF水凝膠的壓縮曲線如圖2所示。相比于單網(wǎng)絡(luò)的HEMA水凝膠和MAA水凝膠，隨著SF的引入，雙網(wǎng)絡(luò)的HEMA/SF和MAA/SF展現(xiàn)出更多的剛性特征。HEMA/SF雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在絲素蛋白質(zhì)量濃度為0.15 g×mL-1時(shí)應(yīng)力從8增加至42 MPa，提高了5倍以上。隨著SF濃度進(jìn)一步增加，HEMA/SF水凝膠在壓縮應(yīng)變88% 時(shí)發(fā)生破裂。對于MAA/SF水凝膠而言，在絲素蛋白質(zhì)量濃度為0.20 g×mL-1時(shí)能夠同時(shí)達(dá)到95% 壓縮應(yīng)變和最大強(qiáng)度58 MPa，相比于單網(wǎng)絡(luò)MAA的5 MPa提高了11倍。

圖2 HEMA/SF與MAA/SF體系的壓縮曲線

如圖3所示，SF的引入帶來的剛性特征反映在彈性模量和壓縮應(yīng)變能的顯著提高。HEMA/SF雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在絲素蛋白質(zhì)量濃度為0.2 g×mL-1時(shí)彈性模量達(dá)到了5.3 MPa ，相比HEMA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的0.06 MPa提升近100倍；MAA/SF雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠彈性模量也實(shí)現(xiàn)了大幅提升，最高達(dá)到了2.17 MPa。SF強(qiáng)化水凝膠的應(yīng)變能也獲得了相應(yīng)的提高。由于HEMA/SF-0.2中絲素蛋白含量過高而破裂，HEMA/SF雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠最大應(yīng)變能出現(xiàn)在HEMA/SF-0.15時(shí)，為3.17 MJ×m-3。而對于MAA/SF雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠而言，隨著絲素蛋白質(zhì)量濃度的增加，MAA/SF-0.2最高應(yīng)變能達(dá)到了4.64 MJ×m-3。

圖3 HEMA/SF與MAA/SF體系的壓縮彈性模量與應(yīng)變能

3.3 拉伸性能

如圖4所示，HEMA/SF和MAA/SF水凝膠的拉伸測試能夠更顯著地體現(xiàn)SF網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)化效果。在HEMA/SF體系中，HEMA/SF水凝膠在SF質(zhì)量濃度增加至0.15 g×mL-1時(shí)的拉伸強(qiáng)度由0.2增加至1.1 MPa，拉伸應(yīng)變從650% 降低至400%，SF在為水凝膠提供強(qiáng)度的同時(shí)，也限制了拉伸應(yīng)變。而在MAA/SF體系中，MAA/SF水凝膠在SF質(zhì)量濃度增加至0.15 g×mL-1時(shí)的拉伸強(qiáng)度由0.16增加至0.45 MPa，拉伸應(yīng)變則保持330%，當(dāng)SF質(zhì)量濃度增加至0.20 g×mL-1時(shí)，拉伸強(qiáng)度進(jìn)一步增加至0.55 MPa，拉伸應(yīng)變降低至200%。與壓縮測試的結(jié)果相一致，在MAA/SF中，SF質(zhì)量濃度的增加在顯著提升應(yīng)力的同時(shí)，仍然能夠保持較好的應(yīng)變能力。

圖4 HEMA/SF與MAA/SF體系的拉伸曲線

與壓縮性能類似，經(jīng)過絲素蛋白網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)化后的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在拉伸彈性模量與能量吸收上有顯著提升。當(dāng)SF質(zhì)量濃度增加至0.20 g×mL-1時(shí)，HEMA/SF的彈性模量從0.10 增加至6.6 MPa，斷裂能從0.07增加至0.36 MJ×m-2，MAA/SF的彈性模量從0.06 增加至2.7 MPa，斷裂能從0.04增加至0.17 MJ×m-2。

圖5 HEMA/SF與MAA/SF體系的拉伸彈性模量與斷裂能

3.4 疲勞測試

水凝膠對疲勞的抵抗通過壓縮循環(huán)測試來進(jìn)行評估。以60%壓縮應(yīng)變?yōu)樯舷?，對HEMA/SF和MAA/SF水凝膠的壓縮循環(huán)進(jìn)行了5次記錄(見圖6)。從圖中可以看到，在第1次循環(huán)和第2次循環(huán)中，由于可能存在的應(yīng)力集中區(qū)域的破壞，導(dǎo)致2次循環(huán)在60% 應(yīng)變處的壓縮應(yīng)力出現(xiàn)較大差異。隨著壓縮次數(shù)的增加，HEMA和MAA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠在60% 壓縮應(yīng)變處的壓縮強(qiáng)度逐漸下降，而當(dāng)SF網(wǎng)絡(luò)引入之后，水凝膠展現(xiàn)出了較好的疲勞抵抗能力。對于HEMA/SF水凝膠而言，5次循環(huán)在60% 應(yīng)變條件下的壓縮強(qiáng)度相同，且均保持在起始值附近，而對于MAA/SF水凝膠而言，隨著絲素蛋白質(zhì)量濃度的提高，水凝膠的抗疲勞性能逐步降低。這些結(jié)果說明，絲素微纖維網(wǎng)絡(luò)在第1次壓縮中產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)改變，但這種改變后的結(jié)構(gòu)在后續(xù)過程中能夠得以維持。

圖6 HEMA/SF與MAA/SF體系的壓縮循環(huán)曲線

3.5 SF強(qiáng)化水凝膠的結(jié)構(gòu)

如圖7所示為SF強(qiáng)化雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在SEM下的斷面照片。水凝膠的網(wǎng)絡(luò)展現(xiàn)出明顯的兩相組織，稀疏的網(wǎng)格狀組織(圖7(a))與高度有序致密的結(jié)構(gòu)(圖7(b))，其中排列高度有序致密的結(jié)構(gòu)(圖8(b))含量較高，與該凝膠中絲素蛋白含量一致，因此可推測為SF網(wǎng)絡(luò)，其高度統(tǒng)一的取向可能與SF本身具備的有序性以及聚合過程中熱誘發(fā)結(jié)合時(shí)的傳熱方向有關(guān)。

圖7 HEMA/SF雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的SEM照片

從SEM的結(jié)果可以推測，絲素蛋白的加入成為了雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的支撐組分，顯著提升了水凝膠的彈性模量和壓縮強(qiáng)度。作為物理交聯(lián)的剛性支撐網(wǎng)絡(luò)，在第1次壓縮后形成了具有一定適應(yīng)性的穩(wěn)定剛性絲素蛋白網(wǎng)絡(luò)。在受到應(yīng)力作用時(shí)，通過與柔性網(wǎng)絡(luò)的相互作用，起到有效的機(jī)械能耗散作用。另一方面，柔性網(wǎng)絡(luò)阻隔了絲素蛋白網(wǎng)絡(luò)的相互接觸，使絲素網(wǎng)絡(luò)不會在壓縮條件下形成新的結(jié)晶區(qū)，而使絲素蛋白微纖維網(wǎng)絡(luò)失去恢復(fù)能力(見圖8)。因此，該絲素微纖維與柔性親水性聚合物形成的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠不僅能夠利用雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的強(qiáng)化機(jī)理提高力學(xué)性能，而且能夠在適應(yīng)性絲素蛋白網(wǎng)絡(luò)形成后保持優(yōu)良的抗疲勞能力。

圖8 雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠可能的強(qiáng)化機(jī)制

4 結(jié) 論

(1) 本文采用一鍋法合成了2種絲素蛋白微纖維增強(qiáng)的物理交聯(lián)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。

(2) 通過壓縮拉伸測試證明了經(jīng)絲素蛋白微纖維強(qiáng)化后的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的壓縮和拉伸強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)5~10倍提升，彈性模量和能量吸收也提高了一個(gè)數(shù)量級以上。同時(shí)在壓縮循環(huán)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其雖然在第1次壓縮后彈性模量有較大的回落，但最高強(qiáng)度幾乎未降，也證實(shí)了其物理交聯(lián)在結(jié)構(gòu)重構(gòu)后具備了良好的抗疲勞能力。

(3) 通過對水凝膠在掃描電鏡下的斷面形貌分析，對其微觀結(jié)構(gòu)與強(qiáng)化機(jī)制做出初步的推測，即絲素蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)作為骨架網(wǎng)絡(luò)保持其結(jié)構(gòu)的可恢復(fù)能力，并與柔性聚合物填充網(wǎng)絡(luò)協(xié)同，實(shí)現(xiàn)機(jī)械強(qiáng)度大幅提升。

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Strong double network hydrogels reinforced by silk fibroin microfibers

MA Ming-yu1, LIU Si-hang1, CHEN Sheng-fu1

(1. College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

Traditional hydrogels are too weak to meet the requirements of strength in tissue engineering. A strategy of strengthening was proposed that combined traditional linear hydrophilic polymers with SF nano-fiber. Silk fibroin (SF) is a biocompatible natureprotein which can be applied as a strengthening material by physically crosslinked with microfiber networks. Two double network hydrogels, hydroxyethyl methacrylate/silk fibroin(HEMA/SF) and methacrylamide/silk fibroin (MAA/SF), were prepared through a one-pot method. The results show that the double network hydrogels improve strength by 5-10 times and also increase modulus and energy absorption after being reinforced by SF microfiber network. Compared with chemically crosslinked double network hydrogels, the physically crosslinked double network hydrogel is tougher and more reversible.

tough hydrogel; silk fibroin; double network; physical crosslinking; mechanical property

O648.17

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2021.01.017

1003-9015(2021)01-0148-07

2020-04-17；

2020-06-05。

國家自然科學(xué)基金(21674092，21975216)。

馬鳴宇(1996-)，男，湖北荊門人，浙江大學(xué)碩士生。

陳圣福，E-mail：schen@zju.edu.cn