徐凱迪 陳浩 宋智青 丁昌江

摘要 以紫花苜蓿為誘變材料，通過研究NaCl和高壓電場(chǎng)的協(xié)同作用，探究高壓電場(chǎng)誘變紫花苜蓿的有效方法。結(jié)果表明，經(jīng)過NaCl和高壓電場(chǎng)的協(xié)同處理后，存活率達(dá)到對(duì)照組的50%以下，處理組紫花苜蓿的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗高和鮮重都比對(duì)照組低，活性氧（ROS）含量較對(duì)照組顯著升高。結(jié)果表明，NaCl能夠提高電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿的輻射敏感性。同時(shí)，為研究高壓電場(chǎng)中的非均勻電場(chǎng)和離子風(fēng)的各自貢獻(xiàn)，利用高壓電場(chǎng)加遮擋處理紫花苜蓿，結(jié)果證明，在NaCl與高壓電場(chǎng)的協(xié)同作用中，離子風(fēng)起了重要的作用。該研究找到NaCl與高壓電場(chǎng)聯(lián)合處理提高紫花苜蓿致死率的方法，并為紫花苜蓿的誘變工作提供了新方法，為高壓電場(chǎng)誘變技術(shù)更廣泛的應(yīng)用提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 NaCl;高壓電場(chǎng);紫花苜蓿;輻射敏感性

中圖分類號(hào) S541+.1? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）04-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.001

Study of NaCl Cooperating with High Voltage Electric Field to Improve Radiosensitivity of Alfalfa

XU Kai-di，CHEN Hao，SONG Zhi-qing et al （College of Science，Inner Mongolia University of Technology，Hohhot，Inner Mongolia 010051）

Abstract Alfalfa was used as the mutagenesis material to explore the effective method of mutagenesis of alfalfa by HVEF through studying the synergistic effect of NaCl and HVEF.The experimental results showed that after the synergistic treatment of NaCl and HVEF，the survival rate was less than 50 percent of the control group，the stem length，root length，seedling height and fresh weight of alfalfa in the treatment group were lower than that in the control group，and the content of reactive oxygen species （ROS） was significantly higher than that in the control group.The experimental results showed that NaCl could improve the radiosensitivity of HVEF to alfalfa.

At the same time， in order to study the contribution of non-uniform electric field and ion wind in high voltage electric field， alfalfa was treated with high voltage electric field and shielding. The results showed that ion wind played an important role in the synergy of NaCl and high-voltage electric field.

In this research，a method was found to increase the fatality rate of alfalfa treated with NaCl combined with HVEF，which provided a new method for the mutagenesis of alfalfa and provided an experimental basis for the wider application of HVEF mutagenesis technology.

Key words NaCl;High voltage electric field;Alfalfa;Radiosensitivity

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51767020）;內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020MS01016，2019MS06025）。

作者簡(jiǎn)介 徐凱迪（1993—），男，安徽蚌埠人，碩士研究生，研究方向：電磁生物技術(shù)。通信作者，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，從事環(huán)境生物物理方面的研究。

收稿日期 2020-07-23

紫花苜蓿是多年生豆科開花植物，它具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、草質(zhì)優(yōu)良、易于家畜消化等特點(diǎn)，是養(yǎng)殖業(yè)首選飼料，在畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)耕作及生態(tài)環(huán)保等方面起著非常重要的作用[1]。目前，天然草地的劣變導(dǎo)致飼草產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，草畜失衡的矛盾日益加劇，嚴(yán)重制約了畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展。紫花苜蓿的誘變育種工作具有重要的意義。當(dāng)前對(duì)于紫花苜蓿已有變異性的發(fā)掘利用，還遠(yuǎn)未接近理論上生產(chǎn)能力。因此，誘變育種方法的改進(jìn)和創(chuàng)新顯得十分重要。

高壓電場(chǎng)（high voltage electric field，HVEF）誘變技術(shù)是一種新型的物理誘變技術(shù)，它是通過將生物樣品放在下極板上，然后給上極板（針狀、線狀等不同形狀的電極）加一定幅度的直流或交流高電壓，在兩電極間形成電暈電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)物理誘變。該誘變技術(shù)具有裝置簡(jiǎn)便、能耗低、不污染環(huán)境、樣品熱效應(yīng)低和誘變率高等優(yōu)點(diǎn)，已獲得中國(guó)實(shí)用新型專利授權(quán)[2-3]。電暈電場(chǎng)是能產(chǎn)生局部電暈放電的非均勻電場(chǎng)。在非均勻電場(chǎng)中，電極的尖端處電力線最集中，電場(chǎng)強(qiáng)度也最大。當(dāng)前的研究認(rèn)為，高壓電暈電場(chǎng)誘變效應(yīng)是2種物理因素協(xié)同作用產(chǎn)生的：一種是非均勻電場(chǎng)的作用;另一種是電暈放電產(chǎn)生的低溫等離子體在電場(chǎng)作用下形成離子風(fēng)，離子

風(fēng)會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生沖擊作用。已有的研究發(fā)現(xiàn)，利用高壓電暈電場(chǎng)可產(chǎn)生多種生物效應(yīng)，例如可獲得高效高產(chǎn)的突變菌;可以提高豌豆、小麥、番茄、穿心蓮等多種植物種子的萌發(fā)、生長(zhǎng)和產(chǎn)量;可對(duì)小麥和刺桐種皮產(chǎn)生刻蝕作用，進(jìn)而使其吸水能力提高等[4-9]。將高壓電場(chǎng)誘變技術(shù)應(yīng)用于紫花苜蓿的誘變育種工作具有重要的意義。

該研究首先利用高壓電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿干種子進(jìn)行處理，結(jié)果顯示電場(chǎng)處理對(duì)紫花苜蓿種子的萌發(fā)沒有顯著影響。在誘變育種工作中，通常選擇處理組相對(duì)致死率為50%（甚至更高）為合適的誘變劑量。當(dāng)前的處理方式還達(dá)不到誘變育種的要求。研究表明，NaCl會(huì)提高細(xì)胞和微生物的輻射敏感性，從而增強(qiáng)輻射損傷[10-11]。將NaCl和高壓電場(chǎng)誘變技術(shù)聯(lián)用，擬研究協(xié)同處理對(duì)紫花苜蓿存活率和初期生長(zhǎng)的影響，以期找到高壓電場(chǎng)誘變紫花苜蓿的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料 供試的紫花苜蓿種子為中草3號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供。試驗(yàn)前篩除不良籽粒，蒸餾水沖洗表面雜質(zhì)及浮土。

1.2 儀器 試驗(yàn)裝置如圖1所示。電源為交流電，電壓為0～50 kV連續(xù)可調(diào)，頻率為50 Hz。電極系統(tǒng)為針橫縱間距均為4 cm、針長(zhǎng)為2 cm的多針-板極陣列，接地端為平面鋁板，電極尖端到接地端的距離為4 cm。

1.3 方法

1.3.1 高壓電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿干種子的處理。

將篩選后的干種子均勻擺放在直徑為10 cm、含有3層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿50粒種子。對(duì)紫花苜蓿干種子進(jìn)行電場(chǎng)處理，電壓為臨近擊穿電壓，處理時(shí)間為10、20、30和40 min，處理完后測(cè)其發(fā)芽率。

1.3.2 NaCl適宜濃度的篩選。

為了研究NaCl對(duì)高壓電場(chǎng)作用效果的影響，希望找出NaCl單獨(dú)作用對(duì)紫花苜蓿萌發(fā)沒有影響的濃度。將篩選后的干種子均勻擺放在直徑為10 cm、含有3層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿50粒種子。NaCl濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，設(shè)置對(duì)照組，每隔1 d更換培養(yǎng)皿中的濾紙，以保持NaCl濃度和水分恒定。待第8天測(cè)其發(fā)芽率。

1.3.3 NaCl協(xié)同高壓電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿種子的處理。

對(duì)紫花苜蓿種子進(jìn)行48 h左右的預(yù)處理（分別浸泡于NaCl和去離子水中），等種子吸脹、萌動(dòng)后再進(jìn)行電場(chǎng)處理。采用的電壓為17 kV、NaCl濃度為0.8%（通過NaCl濃度篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.8% NaCl處理紫花苜蓿的發(fā)芽率與對(duì)照組沒有太大變化）。把種子分為6組，每組3皿，分別記為NaCl+HVEF、HVEF、NaCl、對(duì)照組（Con）、NaCl+HVEF+Cov（加厚度為1 mm的聚丙烯培養(yǎng)皿蓋遮擋，簡(jiǎn)稱NHC）、HVEF+Cov（簡(jiǎn)稱HC）。高壓電場(chǎng)處理方式為先在電場(chǎng)下處理4 h，關(guān)閉電場(chǎng)，待12 h后，再繼續(xù)電場(chǎng)下處理4 h。在電場(chǎng)下處理時(shí)，待濾紙快干時(shí)更換濾紙。每次處理重復(fù)3次。

1.3.4 存活率檢測(cè)。

將處理完的種子放在含有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，每隔1 d更換每個(gè)培養(yǎng)皿中的濾紙，以保持NaCl濃度和水分恒定。將種子置于光照培養(yǎng)箱中26 ℃恒溫培養(yǎng)，種子出芽后，給光照培養(yǎng)箱加140 lx光照條件，連續(xù)光照14 h、黑暗10 h進(jìn)行培養(yǎng)，8 d后統(tǒng)計(jì)存活率。經(jīng)高壓電場(chǎng)處理后，HVEF、NaCl、Con、NaCl+HVEF+Cov、HVEF+Cov 這5組以種子發(fā)芽率為存活率，通過觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)NaCl+HVEF處理后，紫花苜蓿幼苗在長(zhǎng)勢(shì)上不如3組對(duì)照且萌發(fā)后的種子接下來也會(huì)慢慢凋亡，所以規(guī)定經(jīng)NaCl+HVEF處理后，紫花苜蓿幼苗苗高在3.5 cm（包括3.5 cm）以上時(shí)能夠成活。

1.3.5 形態(tài)學(xué)檢測(cè)。培養(yǎng)8 d后分別測(cè)量其莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)和苗高，并測(cè)量第2、4、6、8天的鮮重。

1.3.6 幼苗活性氧（ROS）含量測(cè)定。

分別在接種第2天隨機(jī)選取0.2 g同一處理的幼苗冰浴研磨后進(jìn)行ROS的測(cè)定，檢測(cè)采用的底物是2′，7′-二氯氫化熒光素乙二酯。采用Sudhakar等[12]的方法，待測(cè)樣品用10 mmol/L的CM-H2DCFDA在25 ℃下黑暗反應(yīng)30 min，然后放入酶標(biāo)儀（SPECTRAMAX I3，MOLECULAR DEVICES Corporation，USA）中，以485 nm的激發(fā)光激發(fā)，檢測(cè)530 nm發(fā)射光的熒光強(qiáng)度。6次以上重復(fù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析。所有處理都至少進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件和單因素方差分析（ANOVA）分析數(shù)據(jù)差異，P<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿干種子發(fā)芽率的影響

由圖2可知，在電壓為20 kV時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，紫花苜蓿的發(fā)芽率并沒有明顯變化。說明在臨近擊穿電壓下，處理時(shí)間對(duì)紫花苜蓿發(fā)芽率無太大影響。選用NaCl對(duì)紫花苜蓿種子進(jìn)行預(yù)處理之后，再放在電場(chǎng)下進(jìn)行處理，以期找到高壓電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿半致死的方法。

2.2 NaCl適宜濃度的篩選 由圖3可知，在0.2%、0.4%、0.6、0.8%的NaCl中，紫花苜蓿干種子的發(fā)芽率同對(duì)照組相比沒有顯著變化。當(dāng)濃度為1.0%時(shí)，紫花苜蓿干種子的發(fā)芽率開始下降。0.8% NaCl是紫花苜蓿適宜的濃度。

2.3 NaCl協(xié)同高壓電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿存活率的影響 由圖4可知，在經(jīng)高壓電場(chǎng)（HVEF）、NaCl處理后無論有無遮擋的種子，它們的存活率與對(duì)照組（Con）相比差異都不明顯。但經(jīng)NaCl+HVEF處理后，紫花苜蓿存活率最低，并與其他組有顯著性差異。

2.4 NaCl協(xié)同高壓電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)和苗高的影響 由圖5可知，莖長(zhǎng)在6種處理下，NaCl與HVEF、NHC、HC組之間無顯著差異;從根長(zhǎng)看，NHC與NaCl、HVEF、Con組之間無顯著差異，HC與NaCl、Con組之間無顯著差異;從苗高看，NaCl、HVEF、HC、NHC這4組之間無顯著差異。從整體可以看出，NaCl+HVEF處理的紫花苜蓿莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)和苗高最短，且與其他5組有顯著差異。

2.5 NaCl協(xié)同高壓電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿幼苗鮮重的影響

由圖6可知，高壓電場(chǎng)處理之后，在第8天，NaCl與HVEF、NHC、HC之間無顯著差異，但經(jīng)過NaCl+17 kV處理過的紫花苜蓿幼苗鮮重最低，且與其他5組有顯著差異。

2.6 高壓電場(chǎng)處理后紫花苜蓿幼苗ROS含量的變化

研究表明，ROS在介導(dǎo)DNA損傷以及輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)方面非常重要[13-15]。為檢測(cè)ROS是否起到了重要作用，定量檢測(cè)了輻射后ROS的產(chǎn)生，結(jié)果表明，處理組ROS含量顯著高于對(duì)照組。

3 討論

該研究以中草3號(hào)紫花苜蓿種子為試材，用NaCl協(xié)同高壓電場(chǎng)共同作用于紫花苜蓿，觀察其幼苗形態(tài)指標(biāo)，結(jié)果表明，NaCl和高壓電場(chǎng)共同處理紫花苜蓿種子達(dá)到了誘變育種對(duì)存活率的要求，NaCl和高壓電場(chǎng)分別單獨(dú)作用紫花苜蓿，對(duì)其存活無顯著影響，說明NaCl可以提高高壓電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿的輻射敏感性。經(jīng)過處理后，紫花苜蓿莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗高和鮮重較對(duì)照組顯著降低。這表明NaCl協(xié)同高壓電場(chǎng)共同作用于紫花苜蓿，可以使紫花苜蓿的生長(zhǎng)活力降低，進(jìn)而使紫花苜蓿生長(zhǎng)緩慢。

通常認(rèn)為，種子在吸脹萌發(fā)期間，細(xì)胞膜的完整性和修復(fù)能力是影響種子萌發(fā)的重要因素。膜修復(fù)快，外滲物質(zhì)少，種子活力則較高;反之，外滲物質(zhì)多，種子活力則較低。過高的電場(chǎng)將產(chǎn)生過大的顯質(zhì)力和場(chǎng)致伸縮應(yīng)力，不僅無助于膜相和功能的恢復(fù)，而且可能會(huì)進(jìn)一步破壞種子的膜相，導(dǎo)致種子活力大大降低。該研究顯示，在去離子水和高壓電場(chǎng)作用下，紫花苜蓿的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗高和鮮重都比在去離子水中低，且有顯著差異，這表明高的電場(chǎng)會(huì)使種子活力降低，但達(dá)不到誘變育種的條件。經(jīng)過NaCl和高壓電場(chǎng)共同作用過的紫花苜蓿在所測(cè)指標(biāo)上更低，這可能是NaCl加深了電場(chǎng)對(duì)種子細(xì)胞膜的破壞，外滲物質(zhì)增多，使種子活力降低。

高壓電場(chǎng)生物技術(shù)是一種新型高效的生物誘變技術(shù)，高壓電場(chǎng)生物效應(yīng)是由多種因素協(xié)同復(fù)合作用產(chǎn)生的。對(duì)其物理特性分析可知，高壓電場(chǎng)的生物效應(yīng)主要由2種因素作用形成：一是非均勻電場(chǎng)的作用，二是放電等離子體的作用。為了進(jìn)一步探究高壓電場(chǎng)中兩因素的各自作用及貢獻(xiàn)，在處理紫花苜蓿種子時(shí)，一組直接暴露于高壓電場(chǎng)中，一組加培養(yǎng)皿蓋遮擋，以阻斷離子風(fēng)對(duì)種子的物理化學(xué)刻蝕。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有培養(yǎng)皿蓋遮擋時(shí)，通過對(duì)NaCl、NaCl+HVEF、NHC這3組處理進(jìn)行分析，無論是莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗高，還是鮮重，都可以說明在NaCl與高壓電暈電場(chǎng)的協(xié)同作用中，離子風(fēng)起到了重要的作用。

高壓電場(chǎng)非均勻放電同時(shí)還產(chǎn)生一些化學(xué)物質(zhì)，如活性氧（ROS）。研究表明，ROS在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮著重要作用，并且擁有信號(hào)分子的功能。ROS是電磁因果鏈原初作用中連接物理和生物解釋的一個(gè)重要標(biāo)志，等離子體作用后，在細(xì)胞基質(zhì)中產(chǎn)生的ROS進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞中的大分子發(fā)生作用，從而改變細(xì)胞的代謝活性和遺傳特性。大量研究表明，ROS在高濃度下對(duì)有機(jī)體極其有害，而在低濃度下，ROS能作為第二信使介導(dǎo)植物對(duì)激素或環(huán)境脅迫的多種應(yīng)答反應(yīng)[16-17]。NaCl協(xié)同高壓電場(chǎng)共同作用過的紫花苜蓿ROS含量比對(duì)照組高很多，這表明紫花苜蓿所受的損傷程度更高，不利于種子生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

NaCl可以增強(qiáng)高壓電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿輻射敏感性，提高致死率;在NaCl與高壓電暈電場(chǎng)的協(xié)同作用中，離子風(fēng)起到了重要作用;NaCl協(xié)同高壓電場(chǎng)的處理方法可以應(yīng)用于紫花苜蓿的誘變育種工作。

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