周慧?李文超?黃少卓?蕭展毅?哈睿南?熊志勇?劉波?胡昆鵬

【摘要】目的 分析乙酰輔酶A酰基轉移酶1（ACAT1）在肝癌中的表達及其臨床意義。方法 從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中下載371例肝癌患者癌組織和50例癌旁組織基因表達數(shù)據(jù)及臨床信息，使用t檢驗分析ACAT1在肝癌組織與癌旁組織的表達情況，利用方差分析檢驗ACAT1與患者腫瘤分期[2017年美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）分期標準]、病理分級間的關系;根據(jù)ACAT1表達量中位值將患者分為ACAT1高、低表達2組，采用Kaplan-Meier法分析ACAT1對肝癌的預后價值;Cox回歸分析探討ACAT1是否為判斷肝癌預后的獨立危險因素;采用實時定量PCR法驗證76例肝癌患者癌組織和癌旁組織ACAT1在轉錄水平的表達差異，蛋白免疫印跡法驗證4例肝癌患者癌組織和癌旁組織ACAT1蛋白水平的表達差異。結果 TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示在371例肝癌患者的癌組織中，ACAT1的mRNA表達水平降低（P < 0.001），并隨著腫瘤臨床分期（StageⅠ ～ Ⅲ期）及病理分級（G1 ～ G4級）的升高而降低（P均< 0.001），ACAT1低表達組肝癌患者的總生存率低于高表達組（P < 0.001），且ACAT1表達可成為判斷肝癌預后的獨立危險因子（P = 0.029）。經(jīng)PCR法和蛋白免疫印跡法驗證，無論是在mRNA轉錄水平還是蛋白表達水平上，肝癌組織ACAT1的表達量都低于癌旁組織。結論 ACAT1在肝細胞癌中表達下降，可作為肝癌臨床診斷及預后評估的分子標志物。

【關鍵詞】乙酰輔酶A?；D移酶1;肝癌;診斷;預后

The expression pattern and prognostic value of ACAT1 in hepatocellular carcinoma Zhou Hui， Li Wenchao， Huang Shaozhuo， Xiao Zhanyi， Ha Ruinan， Xiong Zhiyong， Liu Bo， Hu Kunpeng. Department of General Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Hu Kunpeng， E-mail： hkpdhy918@ 126. com

【Abstract】Objective To evaluate the expression level of acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 1 （ACAT1） and its clinical significance in hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods RNAseq and clinical information of 371 HCC and 50 paracancerous samples were obtained from The Cancer Genome Atlas （TCGA） database. The expression pattern of ACAT1 in the HCC and paracancerous samples was statistically compared by t-test. The relationship among ACAT1， tumor staging （AJCC staging criteria） and pathological grading was analyzed by using ANOVA. All patients were classified into the low-and high-ACAT1 expression groups according to the median value of ACAT1 mRNA expression. The prognostic value of ACAT1 for HCC was assessed by Kaplan-Meier method. Whether ACAT1 could be an independent prognostic factor of HCC patients was evaluated by Coxs regression analysis. The expression profile of ACAT1 mRNA between 76 paired HCC and paracancerous tissues was analyzed by real-time quantitative PCR （qRT-PCR）. The expression pattern of ACAT1 protein between 4 paired HCC and paracancerous tissues was analyzed by Western blot. Results TCGA database revealed that the expression levels of ACAT1 were significantly down-regulated in 371 HCC tissues （all P < 0.001）， and remarkably decreased along with the higher tumor clinical staging （stage Ⅰ-stage Ⅲ） and pathological grading （G1-G4） （all P < 0.001）. The overall survival of HCC patients with low ACAT1 expression was significantly lower compared with that of those with high ACAT1 expression （P < 0.001）. The expression of ACAT1 could serve as an independent risk factor for predicting the prognosis of HCC patients （P = 0.029）. qRT-PCR and Western blot demonstrated that the expression of ACAT1 in the HCC samples was significantly lower than that in the paracancerous samples at the mRNA and protein levels. Conclusion The expression level of ACAT1 is down-regulated in HCC tissues， which can be a molecular biomarker for clinical diagnosis and prognosis assessment for HCC.

【Key words】Acetyl-coenzyme A acetyltransferase 1;Hepatocellular carcinoma;Diagnosis;Prognosis

肝細胞癌是最常見的原發(fā)性肝癌，現(xiàn)已成為全球癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。肝細胞癌的主要致病因素為慢性乙型肝炎和黃曲霉毒素B1中毒，中國屬于肝癌高發(fā)地區(qū)，隨著慢性肝臟疾病的患病率逐年上升，肝細胞癌的發(fā)病率也將不斷增加，盡管肝細胞癌的預防、檢測、診斷和治療手段取得了很大進步，但由于肝癌復雜的病理機制以及易侵襲、轉移的特性，使得患者的預后仍不盡人意[2]。因此，尋找新的分子生物標志物，對肝癌具有重要的臨床意義。

乙酰輔酶A酰基轉移酶（ACAT），又稱乙酰乙酰輔酶A硫解酶、β-酮硫解酶，在哺乳動物中存在2種亞型，分別為ACAT1和ACAT2，ACAT1位于線粒體上，ACAT2位于細胞質里[3]。線粒體ACAT1主要參與體內酮體和異亮氨酸的代謝，催化兩分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的可逆過程，在肝內主要參與酮體生成，而在肝外組織主要參與酮體分解。ACAT1缺乏或突變是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，臨床上，輕度患者無明顯癥狀或為嘔吐、腹瀉、脫水等代謝性酸中毒癥狀，重度患者則可能出現(xiàn)昏迷、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育落后甚至死亡[4-6]。近年來，有研究者發(fā)現(xiàn)ACAT1在前列腺癌、乳腺癌和結直腸癌中，參與了腫瘤耐藥和細胞增殖過程，亦有研究者發(fā)現(xiàn)ACAT1的下調可能是腎透明細胞癌的保護因素[7-9]?？梢姡珹CAT1基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥等方面可能存在密切聯(lián)系，ACAT1有望成為腫瘤治療潛在的重要分子靶點。然而，ACAT1在肝癌中的研究鮮有報道，因此，我們將分析ACAT1在肝癌中的表達情況，評估其在肝細胞癌中的診斷、預后評估價值。

材料與方法

一、標本來源

研究中使用的76對肝癌組織和癌旁組織標本來源于2003年1月至2019年12月期間在中山大學附屬第三醫(yī)院行肝癌切除術的患者，所有標本術后均經(jīng)過石蠟包埋、HE染色并有明確病理診斷，其中男50例、女26例。所有患者均簽署知情同意書。

二、數(shù)據(jù)下載

研究中使用的371例肝癌患者（其中有50例包含癌組織和癌旁組織，其余321例僅包括癌組織）ACAT1基因測序信息及臨床信息來源于美國腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫，本研究分析了上述343例（剔除臨床信息不全病例后）肝癌患者腫瘤組織（n = 343）和癌旁組織（n = 50）ACAT1的mRNA表達水平及其與臨床病理參數(shù)的相關性。最后以ACAT1的mRNA表達量中位值為界，將這343例肝癌患者分為ACAT1高表達組和ACAT1低表達組，分析ACAT1對肝癌患者的預后價值。

三、實時定量PCR

使用Trizol-RNA提取試劑（Sigma）提取76例新鮮冷凍肝癌組織樣本及癌旁組織樣本的總RNA，并使用Transcriptor cDNA Synth.Kit2逆轉錄試劑盒（羅氏）將1.0 μg總RNA逆轉錄成cDNA，以PCR儀（頂部加熱型）65℃加熱10 min，添加剩余成分后25℃10 min→55℃30 min。最后使用SYBR GREEN I MASTER （羅氏）進行實時熒光定量PCR檢測（10 μl反應體系）。β-actin作為內參基因。PCR設置程序為：第一步95℃ 5 min，第二步95℃ 10 s→60℃ 20 s→72℃ 20 s 40個循環(huán)，第三步95℃ 5 s→65℃ 1 min→97℃ 5 min→40℃ 10 s。采用Log2-△△Ct （△Ct = CtACAT1-Ctβ-actin）公式算出肝癌組織與癌旁組織間ACAT1的mRNA相對表達量，以ACAT1的mRNA表達量中位值為界，將患者分為ACAT1高表達組和ACAT1低表達組。實驗中使用的引物序列如下，ACAT1上游引物序列：5-GAGGTGCTTCTGCCATGCTA-3，ACAT1下游引物序列：5-TGGTCACATAGGGTTGTCTCCT-3，β-Actin上游引物序列：5-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3，β-Actin下游引物序列：5-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3。

四、蛋白免疫印跡法

使用RIPA裂解液提取4例肝癌患者腫瘤組織和癌旁組織蛋白，BCA法（Thermo scientific）測定蛋白濃度，取50 μg蛋白制備樣品;將上述樣品上樣至10% SDS-PAGE凝膠，恒壓60 V電泳30 min將樣品壓至分離膠，改換恒壓120 V至電泳結束;隨即恒壓100 V下轉膜90 min，將蛋白轉至0.22 μm PVDF膜上;5%脫脂牛奶封閉2 h，目的條帶置于ACAT1一抗稀釋液中（1∶1000，Abcam），內參條帶置于β-actin一抗稀釋液（1∶ 1000，ABclonal）中4℃孵育過夜;室溫孵育兔二抗（1∶5000，ABclonal）1 h，最后進行化學發(fā)光檢測，分析ACAT1蛋白的相對表達量。

五、統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 7.0處理數(shù)據(jù)。計量資料以表示，等級資料以例（%）表示。采用配對t檢驗分析TCGA數(shù)據(jù)庫中50例肝癌患者癌組織與對應的癌旁組織ACAT1的表達差異，獨立樣本t檢驗從整體水平分析TCGA數(shù)據(jù)庫中343例肝癌組織與50例癌旁組織ACAT1的表達差異;配對t檢驗分析76例肝癌患者癌組織和癌旁組織ACAT1的表達差異;ACAT1表達量與臨床分期 [2017年美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）分期標準]、病理分級間的關系采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗;采用受試者工作特征（ROC）曲線評價ACAT1對肝癌的診斷價值;用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較用log-rank 檢驗;采用單因素與多因素Cox回歸分析（進入法）肝癌患者預后的影響因素。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、ACAT1基因TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果

在TCGA數(shù)據(jù)庫所獲得的343例肝癌患者中，與50例癌旁組織的正常肝組織相比，ACAT1在肝癌組織中表達下降，且具有統(tǒng)計學意義（P < 0.001），見圖1A。TCGA數(shù)據(jù)庫所獲得的50例肝癌患者中，與癌旁正常組織相比，ACAT1在肝癌組織中表達下降（P < 0.001），見圖1B。隨著患者腫瘤臨床分期（StageⅠ期 ～ Ⅲ期）及病理分級（G1 ～ G4級）升高，ACAT1的轉錄水平不斷下降（總體P均< 0.001），見圖2。以ACAT1 mRNA表達水平的中位值（42.473905）為界，將患者分為ACAT1高表達組和ACAT1低表達組。Kaplan-Meier分析顯示，ACAT1高表達組總生存率高于ACAT1低表達組（HR = 0.437， 95% CI= 0.289 ～ 0.585，P < 0.001），見圖3。

單因素Cox回歸分析顯示，肝癌患者術后總生

存率的影響因素包括臨床分期（P < 0.001）、腫瘤T分期（P < 0.001）、ACAT1 mRNA表達量（P = 0.002），進一步多因素Cox回歸分析顯示，ACAT1 mRNA的表達量跟肝癌患者術后總生存率相關，是肝癌患者預后的獨立危險因子（HR = 0.991， 95%CI = 0.982 ～ 0.999， P = 0.029），見表1。

二、肝癌組織和癌旁組織mRNA和蛋白分析結果

76例肝癌患者的癌組織與癌旁組織實時熒光定量PCR結果顯示，肝癌組織中ACAT1 mRNA相對表達量低于癌旁組織（P < 0.001），見圖4A。此外，本中心4對肝癌患者癌組織與癌旁組織蛋白免疫印跡法結果顯示，肝癌組織中ACAT1蛋白表達水平低于癌旁組織，見圖4B。

討論

在過去幾十年里，全球原發(fā)性肝癌的發(fā)病率一直在上升，肝細胞癌為肝癌的主要類型[10]。治療上，早期肝癌患者可采用手術切除或肝癌局部消融治療;中期肝癌患者可采用局部化學治療栓塞等;而到了晚期，患者雖可采用索拉非尼、雷格拉非尼等激酶抑制劑治療，但治療手段及效果都非常有限。目前，甲胎蛋白是肝癌里應用最廣泛的生物標志物，但由于靈敏度不高，其診斷價值有限[11]。由此可見，尋找新的分子生物標志物，提高肝癌的診斷及預后判斷能力顯得尤為重要。

ACAT1是位于細胞線粒體上的酮體代謝酶，催化酮生成和酮解過程中乙酰輔酶A和兩個乙酰輔酶A分子之間的可逆轉換。在肝臟的酮生成過程中，ACAT1催化兩分子乙酰輔酶A生成乙酰乙酰輔酶A，而在肝外組織的酮分解過程中，ACAT1促進乙酰乙酰輔酶A分解為兩分子乙酰輔酶A[12]。有研究者發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中，ACAT1的表達量較正常前列腺細胞增加，且ACAT1的上調與前列腺癌的低分化、高侵襲性以及較差的預后相關[13-14]。在乳腺癌中，ACAT1可通過促進細胞增殖、轉移來促進腫瘤發(fā)展[15]。在子宮癌的阿霉素治療過程中，ACAT1可通過增加細胞增殖能力、減少細胞凋亡，促進細胞形成對阿霉素耐藥性[16]。ACAT1促進了還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸和脂肪的生成，促進了結直腸癌的發(fā)生[8]。以上研究結果提示，ACAT1可能作為促癌基因，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。

本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中371例肝癌患者的測序結果進行分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，ACAT1的mRNA表達水平明顯低于正常肝組織，并且在對76例肝癌患者PCR分析與4例患者的蛋白免疫印跡分析中，我們驗證了ACAT1在肝癌中的這種差異表達。TCGA分析還顯示，隨著肝癌患者腫瘤的臨床分期（StageⅠ ～ Ⅲ期）及病理分級（G1 ～ G4級）的升高，ACAT1的轉錄水平不斷下降。由于Stage Ⅳ期的樣本量較?。╪ < 10），與Stage Ⅰ期相比，ACAT1的表達量差異不具有統(tǒng)計學意義。我們還發(fā)現(xiàn)，ACAT1對診斷肝癌和非肝癌患者預后有良好的提示作用，在ACAT1表達量低的肝癌患者中，其總生存率遠低于ACAT1表達量高的肝癌患者，且ACAT1表達量低是肝癌患者低生存率的一個獨立危險因素。綜上所述，我們推測ACAT1可能作為一個抑癌基因在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起作用。與我們的研究結果相似的是有學者發(fā)現(xiàn)，在腎透明細胞癌中，ACAT1在癌組織中的表達較癌旁正常組織明顯減少且與不良預后相關[9， 17]。

ACAT1在不同腫瘤中的表達情況不盡相同，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展作用也并未得到一致的結論。由于肝細胞內缺乏分解酮體的反應酶體系，肝內ACAT1主要參與酮體生成，在肝外ACAT1主要參與酮體分解，許多體內外研究表明，酮體能促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長，生酮飲食能減少小鼠腫瘤體積，增加生存時間[18-19]。我們認為，可能由于ACAT1在肝內外組織中參與的酮體代謝過程的差異，導致ACAT1在肝內外腫瘤中的表達情況與作用不一致。因此，需要更進一步地探索ACAT1在腫瘤尤其是在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的機制。

參 考 文 獻

[1] Siegel RL， Miller KD， Jemal A. Cancer statistics， 2020. CA Cancer J Clin，2020，70（1）：7-30.

[2] Yang JD， Hainaut P， Gores GJ， Amadou A， Plymoth A， Roberts LR. A global view of hepatocellular carcinoma： trends， risk， prevention and management. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2019，16（10）：589-604.

[3] Antonenkov VD， Croes K， Waelkens E， Van Veldhoven PP， Mannaerts GP. Identification， purification and characterization of an acetoacetyl-CoA thiolase from rat liver peroxisomes. Eur J Biochem，2000，267（10）：2981-2990.

[4] K?l??-Y?ld?r?m G， Durmu?-Aydo?du S， Ceylaner S， Sass JO. Beta-ketothiolase deficiency： an unusual cause of recurrent ketoacidosis. Turk J Pediatr，2017，59（4）：471-474.

[5] Sundaram S， Nair M， Namboodhiri S， Menon RN. Mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase enzyme deficiency in a 9-month old boy： atypical urinary metabolic profile with a novel homozygous mutation in ACAT1 gene. Neurol India，2018，66（6）：1802-1804.

[6] Abdelkreem E， Harijan RK， Yamaguchi S， Wierenga RK， Fukao T. Mutation update on ACAT1 variants associated with mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase （T2） deficiency. Hum Mutat，2019，40（10）：1641-1663.

[7] Fan J， Lin R， Xia S， Chen D， Elf SE， Liu S， Pan Y， Xu H， Qian Z， Wang M， Shan C， Zhou L， Lei QY， Li Y， Mao H， Lee BH， Sudderth J， DeBerardinis RJ， Zhang G， Owonikoko T， Gaddh M， Arellano ML， Khoury HJ， Khuri FR， Kang S， Doetsch PW， Lonial S， Boggon TJ， Curran WJ， Chen J. Tetrameric acetyl-CoA acetyltransferase 1 is important for tumor growth. Mol Cell，2016，64（5）：859-874.

[8] Zhu Y， Gu L， Lin X， Liu C， Lu B， Cui K， Zhou F， Zhao Q， Prochownik EV， Fan C， Li Y. Dynamic regulation of ME1 phosphorylation and acetylation affects lipid metabolism and colorectal tumorigenesis. Mol Cell，2020，77（1）：138-149.e5.

[9] Zhao Z， Liu Y， Liu Q， Wu F， Liu X， Qu H， Yuan Y， Ge J， Xu Y， Wang H. The mRNA expression signature and prognostic analysis of multiple fatty acid metabolic enzymes in clear cell renal cell carcinoma. J Cancer，2019，10（26）：6599-6607.

[10] Villanueva A. Hepatocellular Carcinoma. N Engl J Med， 2019，380（15）：1450-1462.

[11] Luo P， Wu S， Yu Y， Ming X， Li S， Zuo X， Tu J. Current status and perspective biomarkers in AFP negative HCC： towards screening for and diagnosing hepatocellular carcinoma at an earlier stage. Pathol Oncol Res，2020，26（2）：599-603.

[12] Fukao T， Song XQ， Mitchell GA， Yamaguchi S， Sukegawa K， Orii T， Kondo N. Enzymes of ketone body utilization in human tissues： protein and messenger RNA levels of succinyl-coenzyme A （CoA）：3-ketoacid CoA transferase and mitochondrial and cytosolic acetoacetyl-CoA thiolases. Pediatr Res，1997，42（4）：498-502.

[13] Saraon P， Cretu D， Musrap N， Karagiannis GS， Batruch I， Drabovich AP， van der Kwast T， Mizokami A， Morrissey C， Jarvi K， Diamandis EP. Quantitative proteomics reveals that enzymes of the ketogenic pathway are associated with prostate cancer progression. Mol Cell Proteomics， 2013， 12（6）：1589-1601.

[14] Saraon P， Trudel D， Kron K， Dmitromanolakis A， Trachtenberg J， Bapat B， van der Kwast T， Jarvi KA， Diamandis EP. Evalua-tion and prognostic significance of ACAT1 as a marker of prostate cancer progression. Prostate， 2014， 74（4）：372-380.

[15] Martinez-Outschoorn UE， Lin Z， Whitaker-Menezes D， Howell A， Sotgia F， Lisanti MP. Ketone body utilization drives tumor growth and metastasis. Cell Cycle，2012，11（21）：3964-3971.

[16] Lo YW， Lin ST， Chang SJ， Chan CH， Lyu KW， Chang JF， May EW， Lin DY， Chou HC， Chan HL. Mitochondrial proteomics with siRNA knockdown to reveal ACAT1 and MDH2 in the development of doxorubicin-resistant uterine cancer. J Cell Mol Med，2015，19（4）：744-759.

[17] Chen L， Peng T， Luo Y， Zhou F， Wang G， Qian K， Xiao Y， Wang X. ACAT1 and metabolism-related pathways are essential for the progression of clear cell renal cell carcinoma （ccRCC）， as determined by co-expression network analysis. Front Oncol，2019，9：957.

[18] Skinner R， Trujillo A， Ma X， Beierle EA. Ketone bodies inhibit the viability of human neuroblastoma cells. J Pediatr Surg，2009，44（1）：212-216.

[19] Vidali S， Aminzadeh S， Lambert B， Rutherford T， Sperl W， Kofler B， Feichtinger RG. Mitochondria： the ketogenic diet——a metabolism-based therapy. Int J Biochem Cell Biol，2015，63：55-59.

（收稿日期：2020-10-10）

（本文編輯：楊江瑜）