徐錚，徐愷，陳昱金，李麗，付銘洋

(南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京，211816)

異構酶(isomerase)是七大酶類中的第五種，以EC5分類號命名，催化分子內的幾何或者結構重排?？杉毞譃椴钕虍悩嬅?epimerase)、消旋酶(racemase)、互變異構酶(tautomerase)、變位酶(mutase)和順反異構酶(cis-transisomerase)等。自然界常見的物質如氨基酸和糖類都可能存在同分異構體，其分子質量相同，僅僅是原子空間排布不一致。它們彼此間?？赏ㄟ^異構酶來實現轉化，異構酶催化的反應即異構反應(isomerization)，這類反應往往是受到熱力學影響的可逆反應，即酶對底物和產物都具有催化能力，在達到化學平衡后產物比例不再發(fā)生變化。異構反應最為人熟知的是果葡糖漿的生產過程，即利用葡萄糖異構酶(也稱木糖異構酶、GIase)催化D-葡萄糖獲得D-果糖，轉化率一般為42%[1]。由于D-果糖的甜度較蔗糖高而D-葡萄糖又較之低，因此兩者的混合物甜度與蔗糖接近(10%糖度下，55型果葡糖漿甜度與蔗糖一致、42型甜度為蔗糖的90%左右)。美國盛產玉米，因此大量的玉米淀粉可以水解為D-葡萄糖，進一步可以轉化為果葡糖漿,果葡糖漿的推廣解決了美國玉米產業(yè)的過剩問題，大型飲料企業(yè)如可口可樂在產品中廣泛添加了果葡糖漿并為人熟知。早在2006年全球果葡糖漿產能就達到1 000萬t，被譽為一項劃時代的發(fā)明。果葡糖漿的成功證明了異構酶是具有重要產業(yè)價值的工業(yè)酶，然而許多異構酶催化的反應還沒有得到深入的研究與重視，異構酶在工業(yè)酶中的占比仍比較低(約3%)。針對異構酶的挖掘改造以及應用研究還需要更加深入的總結與思考。本文結合自身的研究經歷，綜述了異構酶在生物制造領域尤其是食品、藥品、藥物中間體方向的研究現狀并展望了未來發(fā)展方向，為異構酶的開發(fā)研究提供借鑒。

1 異構酶與生物制藥

乳果糖(lactulose)也叫乳酮糖,是D-半乳糖基和D-果糖基通過β-1,4糖苷鍵連接而成的還原性二糖,具有治療便秘、肝性腦病、調節(jié)腸道菌群等功效，是人類最早使用的益生元之一[2]。乳果糖在一百多個國家作為非處方藥銷售，2009年全球需求量就已突破5萬t。乳果糖是乳糖的同分異構體，乳糖在堿性加熱的條件下就可以自發(fā)異構為乳果糖。乳果糖的化學合成方法簡單，使用硼酸或偏鋁酸鈉在堿性條件下催化即可得到且轉化率較高(一般>75%)[3]。然而硼有毒性、鋁是重金屬，因此必須完全去除才可以作為食藥產品銷售[4]。但徹底去除較為困難，且食藥領域對產品中硼含量的監(jiān)管非常嚴格，因此實際產業(yè)化難度很大；相關技術被國外企業(yè)如蘇威集團、雅培制藥、韓美藥業(yè)等公司壟斷。近來發(fā)現乳果糖可以通過纖維二糖差向異構酶(cellobiose 2-epimerase，EC 5.1.3.11，CE酶)直接催化乳糖得到，另有一定的副產物依匹乳糖(epilactose)產生(圖1)[5]。

圖1 CE酶催化乳糖產生乳果糖和依匹乳糖的示意圖Fig.1 Schematic diagram of CE enzyme catalyzing lactose to produce lactulose and epilose

此后，生物法制備乳果糖的技術路線得到了廣泛重視，已發(fā)表文獻中十多種不同來源的CE酶獲得了研究。其中2012年報道的CE酶來源于極端嗜熱纖維素降解菌Caldicellulosiruptorsaccharolyticus菌株(CSCE酶)，CSCE對乳糖的催化溫度為80 ℃、pH 7.5，產率為58%，生產效率204 g/(L·h)；依匹乳糖產率15%，生產效率54 g/(L·h)，這項技術的出現使得生物異構制造乳果糖成為可能[6]。除了CSCE，已報道的其他CE酶還包括：Caldicellulosiruptorobsidiansis、Dictyoglomusturgidum、Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum、Ruminococcusalbus、Rhodothermusmarinus、Spirochaetathermophila、Bacteroidesfragilis等[7]。然而其中多數來源的酶只產依匹乳糖，如R.albus、R.marinus、B.fragilis等，轉化率約30%[8]，而僅有幾種高溫型CE酶在催化底物數小時內產生乳果糖。以乳糖和硼酸的摩爾比1∶1來添加硼酸，CE酶對乳糖的底物轉化率可以達到88%，副產物含量也較少，其中依匹乳糖不到2%[9]。然而硼酸的用量仍然偏高，徹底去除硼酸的難度很大?，F有催化技術仍以大腸桿菌為主，大腸桿菌可產內毒素，因此不符合食品安全需求，對食品級或GRAS級宿主的開發(fā)是下一步努力的方向。WU等[10]成功將CE酶基因在食品級的枯草芽孢桿菌WB800中表達并制備了固定化酶反應器，結果表明該系統(tǒng)在表達量上能夠達到較高水平；將CE酶固定化為酶膜反應器(enzyme membrane reactor，EMR)后可以重復催化10個批次。由于各國藥典對乳果糖產品中依匹乳糖的含量有嚴格限定，因此如何控制依匹乳糖比例極為重要，實際操作難度很大。有研究表明依匹乳糖也能調節(jié)腸道菌群，是一種潛在的腸道益生元而對人體無害；這為放寬藥典標準提供了可能，因此有必要對依匹乳糖進行充分的研究。這類研究的困難在于如何獲取高純度依匹乳糖：其在色譜分離過程中的出峰時間與乳糖極為接近，因此難以通過色譜法將兩者分離。利用β-半乳糖苷酶可以水解未反應完的乳糖為D-半乳糖和葡萄糖，再通過酵母除去這些單糖；經色譜分離可以得到91.1%純度的依匹乳糖，其缺點在于β-半乳糖苷酶的專一性不強，導致依匹乳糖有16%的損耗[11]。依匹乳糖在動物體內的初步驗證表明：依匹乳糖對雙歧桿菌的增值效果明顯，但對厭氧菌和乳酸菌則一般，總體效果略遜于低聚果糖(fructooligosaccharides，FOS)[12]。

L-核糖(L-ribose)是D-核糖的同分異構體，它是可以通過異構酶制造的藥物中間體[13]。天然的L-型單糖在自然界中含量很低，僅L-阿拉伯糖可以通過生物質大量獲得，因此L-型單糖一直比較昂貴。L-核糖是非天然的L-型五碳糖，只在實驗室中通過合成能夠獲得。L-核糖可以用作已上市的抗乙肝藥替比夫定(telbivudine)的合成砌塊，也可以作為其他幾種尚未上市抗病毒藥物的中間體，如：Clevudine、Levovirin、Maribavir等[14]。其中,英國制藥商夏爾(Shire)宣布美國FDA已授予實驗性抗病毒藥物Maribavir(SHP620)治療移植患者巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染的突破性藥物資格，表明了較好的應用前景。利用L-核糖還可以進一步制備得到2-脫氧-L-核糖，后者可用于生產多種核苷類似物藥物，產品附加值較高。L-核糖的生物制備需要兩步反應，出發(fā)底物為L-阿拉伯糖，中間產物為L-核酮糖(L-ribulose)。第一步反應由L-阿拉伯糖異構酶催化L-阿拉伯糖為L-核酮糖，轉化率低于30%[15]。但由于酮糖可與硼酸結合形成絡合物，因此可以在反應體系中加入硼酸，使得剛生成的L-核酮糖即與硼酸絡合，脫離反應體系，造成化學平衡持續(xù)向生成L-核酮糖的方向移動；最終轉化率可以提升至75%，生產強度375 g/(L·h)[16]。L-核酮糖-硼酸絡合物可以通過樹脂除去大部分的硼而釋放出L-核酮糖，后者通過甘露糖-6-磷酸異構酶(mannose-6-phosphate isomerase，MPI)或L-核糖異構酶(L-ribose isomerase，L-RI)催化為L-核糖[17]。這步反應的轉化率一般為70%，因此兩步反應的最大理論轉化率約為52.5%，高于大多數化學工藝。值得注意的是，L-核酮糖的穩(wěn)定性與pH值和溫度關系密切，在堿性和高溫條件下L-核酮糖的損失很大[18]，因此L-核酮糖在制造工藝中的穩(wěn)定性需要考慮。比較第二步反應的2種酶，MPI多為嗜熱酶，而L-RI均為常溫酶，因此就穩(wěn)定性而言，MPI用于工業(yè)催化的潛力更大，可與嗜熱型L-AI搭配使用。XU等[19]利用固定化的Paenibacilluspolymyxa來源的L-AI酶實現L-阿拉伯糖到L-核酮糖的轉化，轉化率為61.8%。玉米芯是玉米產業(yè)中常見的低值副產物，其中的半纖維素組分主要包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖三種單糖，L-阿拉伯糖占比可達35%。玉米芯常被水解后用于提取D-木糖制備木糖醇或低聚木糖，剩余廢液中的L-阿拉伯糖完全可以用于制備L-核酮糖，這樣的技術路線原料成本很低。即可通過濃縮先將水解液中含量較高的D-木糖結晶出來，剩下的L-阿拉伯糖用L-AI酶催化。由于大腸桿菌等宿主中含有阿拉伯糖操縱子，能夠消耗一定比例的L-核酮糖，因此使用全細胞催化需要敲除阿拉伯糖操縱子相關基因。

2 異構酶與功能糖制造

肥胖可以導致多種衍生疾病，包括糖尿病、心腦血管病、呼吸系統(tǒng)疾病、癌癥等，造成肥胖的主要原因在于糖和脂肪攝入過量以及缺乏運動。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計體質指數(body mass index，BMI)顯示,全球超重和肥胖的人數已超21億，而中國的肥胖人口超越美國排在首位。低熱量的蔗糖替代品將具有無比廣闊的市場，功能糖是指一類具有低熱量、調控血糖以及腸道益生功效的單糖、寡糖或糖醇，備受市場和研究者的關注。通過生物異構法能夠制造的功能糖包括D-塔格糖(D-tagatose)、D-阿洛酮糖(D-psicose或D-allulose)、異麥芽酮糖(isomaltulose)或異麥芽酮糖醇(isomaltitol)、赤蘚糖醇(erythritol)等。D-塔格糖通過L-阿拉伯糖異構酶(L-arabinose isomerase，L-AI)催化D-半乳糖獲得，其甜度為蔗糖的92%，口感則相差無幾，熱量僅為蔗糖的38%[20]。D-塔格糖在烘焙中可以發(fā)生美拉德反應而產生引發(fā)食欲的焦糖色與香味，能夠改善腸道微生物菌群進而促進益生菌生長[21]。由于大部分代糖甜味劑的口感與蔗糖有較大差異，因此在市場中常不受歡迎，而D-塔格糖是目前最適合替代蔗糖的天然甜味劑之一。D-塔格糖曾作為糖尿病藥物進入三期臨床實驗，盡管最終失敗(有研究者認為實驗劑量設計錯誤導致了失敗)，但顯示出在降血糖方面具有一定效果，這對糖尿病患者十分有利。至今已有數十種L-AI酶得到解析研究，包括常溫、嗜熱、超嗜熱型L-AI。其中超嗜熱酶AnoxybacillusflavithermusL-AI的催化溫度能夠達到95 ℃，ThermotogamaritimaL-AI催化溫度達到90 ℃[22]。超嗜熱L-AI的穩(wěn)定性非常好，不容易失活。但過高的反應溫度或偏堿性的催化條件都會造成底物和產物的褐變反應，產生復雜的色素和副產物，因此嗜熱型(最適反應溫度60～70 ℃)條件下的L-AI酶更適于應用。例如Alicyclobacillusacidocaldarius、LactobacillusplantarumNC8、Geobacillusstearothermophilus等來源[23]。而偏堿性條件也會帶來褐變，最適反應pH偏微酸性(pH 6～7)最為有利。XU等[24]篩選到LactobacillusfermentumCGMCC2921來源L-AI酶的最適反應溫度為65 ℃、最適反應pH 6.5，恰好在這一范圍內，具有產業(yè)化應用的潛力。幾乎所有的L-AI酶都是金屬酶(metalloenzyme)，在EDTA處理后會喪失酶活性，金屬離子尤其是二價陽離子對酶活性和熱穩(wěn)定性有很大的提高作用。添加Mn2+和Co2+都能夠起到效果，其中Co2+的效果最好。但由于食品工業(yè)禁用Co2+，故添加Mn2+更為合適[25]。也有研究表明某些L-AI酶不需要額外添加金屬離子，或添加量很小(<1 mmol/L)[26]，可能的原因是活性中心與金屬離子的結合能力較強，故金屬離子不易脫落。D-塔格糖生物制備工藝的缺點在于底物D-半乳糖較為昂貴，由于通過乳糖水解可以獲得D-半乳糖，因此開發(fā)乳糖至D-塔格糖的一步法工藝較有前途。XU等[27]通過共表達β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和L-阿拉伯糖異構酶，實現了從乳糖到D-塔格糖的一步生物法制備[27]。使用食品級宿主也是D-塔格糖生產亟待解決的問題，例如利用pEKEx2質粒可將L-AI基因在谷氨酸棒桿菌中表達，結果取得了較高的表達量[28]。D-塔格糖的純化需要色譜分離，回收的D-半乳糖可以再利用以降低成本，回收工藝一般使用模擬移動床色譜法(simulated moving bed chromatography，SMBC)。由于D-半乳糖是醛糖而D-塔格糖是酮糖，這種差異使其分離效果相對較好，D-塔格糖可以達到很高純度并能夠結晶成為晶體[29]。又由于D-塔格糖的酮糖性質，它可以與硼酸結合形成絡合物，然后脫離反應體系。這會打破反應平衡，使得反應繼續(xù)朝產物生成方向進行，顯著提升終產物含量[30]。

D-塔格糖于2014年在我國被批準為新食品原料，而早在2001年美國FDA即給予它普遍公認安全的GRAS(generally recognized as safe)認證[31]。因此D-塔格糖的應用前景光明，但國內目前僅見數家公司有相關產品且產能很低。其主要限制因素在于成本問題，蔗糖替代品一定是大宗產品，因此必須盡可能降低成本。由于D-半乳糖的產能較小，作為原料使用價格偏高，導致成品D-塔格糖的價格居高不下，達每公斤數百元人民幣。就目前工藝來看，擴大D-半乳糖產能是一條有效的途徑。D-半乳糖的制備一般通過乳糖酶水解乳糖(β-半乳糖苷酶處理)，所得D-半乳糖和葡萄糖通過模擬移動床色譜分離，也可以培養(yǎng)不能消耗D-半乳糖但可以利用葡萄糖的微生物處理水解液獲得高純度的D-半乳糖。除此以外，近期也有報道通過合成生物學方法構建D-塔格糖的直接合成途徑。例如LIU等[32]將2種外源性的氧化還原酶(XR和GDH)和一種乳糖酶gh1-1構建到釀酒酵母中，實現了乳糖直接轉化為D-塔格糖。但這種方法所得D-塔格糖濃度不是特別高(37.7 g/L)，發(fā)酵周期長(300 h)，經濟性還有待進一步考察。

D-阿洛酮糖(D-allulose或D-psicose)是D-果糖的C-3位差向異構體，天然的D-阿洛酮糖可見于無花果中，食用后熱量近乎為零[33]。D-阿洛酮糖可以抑制脂肪肝酶和腸道α-糖苷酶，從而降低體內脂肪的積累和抑制血糖濃度的上升。2014年FDA認證D-阿洛酮糖為GRAS食品，標志其產業(yè)化前景光明。通過D-塔格糖-3-差向異構酶(D-tagatose-3-epimerase，DTE)或D-阿洛酮糖-3-差向異構酶(D-psicose-3-epimerase，DPE)催化D-果糖都可得到D-阿洛酮糖。D-果糖一般由D-葡萄糖經過葡萄糖異構酶催化后再分離獲得，最高可達到90%純度(F90型果葡糖漿)；它的價格低于結晶果糖，作為底物具有成本優(yōu)勢。迄今已有十多種DTE被研究，包括Agrobacteriumtumefaciens、Clostridiumsp.、Clostridiumcellulolyticum、Rhodobactersphaeroides、Pseudomonascichorii等，對高濃度D-果糖的最高轉化率有32.9%(D-果糖質量濃度700 g/L)[34]。DTE酶已在谷氨酸棒桿菌中表達成功，利用20 mg/L青霉素和10%甲苯透性化處理重組谷氨酸棒桿菌，反應40 min對750 g/LD-果糖的轉化率達到31%，實現了食品級宿主制備D-阿洛酮糖的應用[35]。目前的技術瓶頸在于D-塔格糖-3-差向異構酶催化D-果糖的轉化率低，由于該反應是可逆反應，受化學平衡限制轉化率難以提高。解決的方法是篩選具有不同反應機制的新酶，這存在很大的運氣成分；或開發(fā)高效的底物—產物分離方法，使得未反應底物以高收率再利用，降低生產成本。D-阿洛酮糖還可以進一步催化獲得D-阿洛糖，該催化反應使用L-鼠李糖異構酶，轉化率30%[36]。通過模擬移動床技術可以將D-阿洛糖分離得到，純度可達95%[37]。由于轉化率較低，底物過于昂貴，D-阿洛糖的產業(yè)化還需要更多的研究。

異麥芽酮糖(isomaltulose)是蔗糖的同分異構體，它經過化學加氫后可制得異麥芽酮糖醇，也稱帕拉金糖(商品名Palatinose)，是FDA認證的GRAS級食品[38]。異麥芽酮糖通過蔗糖異構酶(sucrose isomerase，SI)催化蔗糖獲得，該催化過程伴有副產物形成，包括海藻酮糖(trehalulose)、少量的單糖D-葡萄糖和D-果糖[39]。有趣的是某些SI酶催化蔗糖產物中海藻酮糖占主要成分，例如P.mesoacidophilaMX-45和A.radiobacterMX-232來源[40-41]；目前還沒有發(fā)現海藻酮糖的用途，因此限制海藻酮糖的產生有實際意義。XU等[42]通過解析SI酶的高分辨率蛋白質晶體結構，發(fā)現活性口袋附近的一段無規(guī)卷曲結構對產物比例有較大影響。在這段loop區(qū)進行氨基酸殘基的替換可以改變終產物中異麥芽酮糖與海藻酮糖的比例，由87%∶13%(海藻酮糖)變?yōu)?4%∶56%。分子動力學模擬研究表明無規(guī)卷曲結構發(fā)生氨基酸殘基替換后，殘基R333與E428形成氫鍵，削弱了R333與呋喃型果糖基的作用。這將導致游離的呋喃型果糖基可以發(fā)生互變異構，形成吡喃型果糖后重新與葡萄糖基團結合產生海藻酮糖，使其比例大幅提升。表面展示是提升催化效率的有效方法，釀酒酵母表面展示技術可用于SI酶的應用，而且釀酒酵母是食品級宿主，因而更具有工業(yè)化前景；LEE等[43]將Enterobactersp.FMB-1來源SI酶通過GPI型壁蛋白錨定在細胞表面，并通過FACS技術篩選高活力的細胞株，經過表面展示的SI酶還具有更好的熱穩(wěn)定性。

3 異構酶與小品種氨基酸制造

自然界常見的氨基酸均為L-構型、D-構型的氨基酸(包括D-與L-混合的DL-型)結構獨特，較為罕見，因此具有特殊用途。DL-丙氨酸是L-丙氨酸的消旋產物，甜度較大可用做食品調味劑或營養(yǎng)強化劑；也可用于合成維生素B6或用作農藥與醫(yī)藥中間體等。DL-丙氨酸可通過異構酶反應生產，利用丙氨酸消旋酶(L-alanine racemase)催化部分L-丙氨酸為D-丙氨酸(轉化率50%)，所獲得產品即旋光度為零的DL-丙氨酸。已報道的丙氨酸消旋酶來源于Streptoccocusfaecalis、Salmonellatyphimurium、Bacillussubtilis等微生物[44]，但利用食品級宿主表達丙氨酸消旋酶才能用于食品工業(yè)，DL-丙氨酸經微生物降解后還可以獲得純的D-丙氨酸可用于其他用途。與之類似，DL-谷氨酸也可以通過谷氨酸消旋酶(glutamate racemase)催化L-谷氨酸獲得，DL-谷氨酸再經過谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD酶)作用產生γ-氨基丁酸(GABA)和D-谷氨酸，經過下游分離可以將兩者分開[45]；由于DL-和D-谷氨酸的價格昂貴，故由此工藝可以提高L-谷氨酸的產品附加值。以上研究表明，異構酶可以提升氨基酸的產品附加值，為小品種氨基酸的產業(yè)化制備提供了途徑。

4 工業(yè)用異構酶的改造研究

學者們針對前述各類異構酶展開了大量研究，主要目的在于改造它們從而獲得更好的催化性能和熱穩(wěn)定性(如表1總結)，下面列舉有代表性的案例。對CE酶的改造包括酶活力的提升、熱穩(wěn)定性增強、副產物降低等幾個方面。對RuminococcusalbusCE的研究表明保守殘基R52、H243、E246、W249、W304、E308和H374影響酶活力，其丙氨酸突變體均完全失活，F114和W303也對活性有很大影響。晶體結構研究表明，H243、W249、H374、H377和M378位于活性中心入口處，R52和F114在活性中心的底部，2個組氨酸H374和H243作為廣義酸堿執(zhí)行催化反應；活性口袋的整體疏水性較強，確保底物不被水解[46]。對CSCE的研究表明，雙點突變E161D/N365P酶活性半衰期延長了4倍，最適反應溫度由80 ℃上升到87.5 ℃，對乳糖的催化效率kcat/Km上升了29%[47]。通過4輪基于隨機突變的定向進化篩選，SHEN等[48]又將CSCE的酶活性和催化效率分別提升了2.8和3倍，突變體酶有5個位點改變(R5M/I52V/A12S/K328I/F231L)。令人意外的是突變體酶不產依匹乳糖，使得乳果糖產率上升到76%。由于R5、A12、K328和F231都是位于CSCE酶表面的殘基，因此它們對產物選擇性的影響尚無法闡述。而I52距離活性中心仍然較遠，因而需要晶體結構研究進一步揭示這些殘基對催化產生的影響。對L-AI酶的改造包括酶活力提升、最適溫度和pH改造等，G.thermonitrificansL-AI的突變體F280 N/C450S/N475K具有更高的轉換數kcat值，達到6 245 min-1，催化效率kcat/Km達到4.7 L/(mmol·min)[49]。對MPI酶的改造包括定點突變獲得R142 N突變體，其kcat值達到81 063 s-1，是野生型的1.6倍[50]?？偨Y以上研究可得出結論，異構酶普遍缺乏高通量的突變體篩選方法，產物檢測依賴高效液相色譜，因此常使用基于理性設計的定點突變方法以減少樣品數量。

表1 針對工業(yè)異構酶的部分改造研究Table 1 Summary of modifications on industrial isomerases

5 異構酶在生物制造中的前景展望

異構酶是生物異構反應的關鍵，因此挖掘性能更好的異構酶或對現有酶源進行改造是研究的重點。異構酶多具有寬泛的底物譜，但對每一種底物的轉化率可能都不高，篩選到優(yōu)異的新酶常有賴于“運氣”；盲目性比較大。因此基于定向進化或理性設計改造現有酶庫是更加可行的手段，這需要建立一個簡便的具有普適性的高通量篩選方法。近年來,基于流式細胞儀的熒光激活細胞分選術成功應用于多種工業(yè)酶的高通量篩選，該技術對于異構酶也應具有良好的效果，但設計異構產物相應的高特異性指示探針是先決條件。另一方面，由于工業(yè)化過程的環(huán)境較為苛刻，因此對酶的穩(wěn)定性提出很高要求。解決這一問題的思路分以下幾種：(1)篩選嗜熱酶，嗜熱酶具有較高的反應溫度(一般達到60～90 ℃)，這類酶在常溫或低溫下的穩(wěn)定性十分優(yōu)異，適合儲存也適合重復利用；催化中一般采用略低于最適反應溫度的條件，同時延長反應時間，可以達到最優(yōu)效果并大幅提升活性半衰期，顯著降低制備或購買酶帶來的成本。(2)開發(fā)固定化酶技術，將新型材料與異構酶結合，近年來較熱門的材料包括金屬有機框架材料、磁性納米微粒、無機雜化納米花等。已發(fā)現的異構酶多數屬于金屬酶，需要金屬離子參與反應或幫助穩(wěn)定酶的三維構象，因此在反應或貯存過程中添加一定濃度的金屬離子有助于提高酶的活性和穩(wěn)定性。然而，離子的選擇應當考慮到產品的應用場景，例如許多離子在食品行業(yè)中是禁止的，研發(fā)時應優(yōu)先考察金屬離子濃度需求較低的酶源。異構反應的一個優(yōu)勢在于很少需要輔因子或輔酶的介入，因此不需要添加非常昂貴的輔因子或輔酶，也無需使用完整細胞即可實現催化，這在很大程度上增加了異構酶產業(yè)化的可能性。當然我們要看到，異構反應也有其缺陷的一面，例如異構反應一般是可逆反應，底物在催化過程中無法實現全部轉化；未得到利用的殘留底物一方面降低了生產效率，另一方面增加了產物分離提取的難度。此外，異構反應的轉化率受熱力學影響很大，許多反應要在較高溫度下才能獲得滿意的轉化率，這對酶的來源(是否為嗜熱酶)、酶的熱穩(wěn)定性、底物和產物的穩(wěn)定性、高溫是否產生副產物等都提出了一定要求。前述也提到可用兩步氧化還原反應替代一步異構反應，并取得不錯的效果。因此我們在生物制造的路線選擇中應當靈活選用，以追求更低成本和更高效率作為最根本的標準。總的來說，異構酶在生物制造中的應用領域逐年拓寬，近十年來的技術積累已厘清了技術革新的方向，相信異構酶在新一代生物制造技術中將占有一席之地。