王偉佳，高曉夏月,劉愛(ài)國(guó)*，劉立增，王鵬程，楊毅

1(天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津，300134)2(彼特銳斯(天津)商貿(mào)有限公司，天津，300240)

在全世界各地區(qū)人群中都存在不同程度的乳糖酶缺乏，而且有明顯的種族差異[1]。據(jù)調(diào)查，我國(guó)漢族成人乳糖不耐癥發(fā)生率為75%～95%，少數(shù)民族亦有76%～95.5%[2]。肖玉樺等[3]用氫呼氣試驗(yàn)測(cè)定健康成人乳糖吸收不良發(fā)生率為92%。楊月欣等[4]在北京、上海、廣州和哈爾濱四大城市，從3～13歲兒童中隨機(jī)抽樣，87%的兒童乳糖酶活性下降的年齡在7～8歲，且我國(guó)其他地區(qū)兒童乳糖酶缺乏的發(fā)生率也較高。

酸奶在發(fā)酵前進(jìn)行熱處理會(huì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜的變化[5-8]：(1)美拉德反應(yīng)使原料乳中風(fēng)味物質(zhì)變化，進(jìn)而影響酸奶產(chǎn)品的風(fēng)味；(2)減少了致病菌和有害微生物的數(shù)量；(3)致使微觀結(jié)構(gòu)改變并對(duì)酸奶宏觀特性有顯著影響。熱處理溫度低的酸奶凝膠呈現(xiàn)出含有較大酪蛋白顆粒的彎曲狀團(tuán)聚網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這是由于未變性的乳清蛋白沒(méi)有參與凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。經(jīng)過(guò)熱處理的酸奶凝膠具有更加致密，相互交聯(lián)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，原因是乳清蛋白發(fā)生部分變性或者全部變性，會(huì)參與網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，這增加了蛋白之間的交聯(lián)，此結(jié)構(gòu)中的孔徑更小，可以使顆粒重排現(xiàn)象減少[9],從而導(dǎo)致酸奶的貯藏穩(wěn)定性、風(fēng)味釋放、質(zhì)地以及流變學(xué)等特性發(fā)生變化。

本論文旨在討論熱處理對(duì)無(wú)乳糖酸奶理化性質(zhì)的影響，同時(shí)與普通酸奶在表觀黏度、色度、滋味、氣味、貯藏穩(wěn)定性以及微觀結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行比較。

1 方法與材料

1.1 試劑與儀器

全脂乳粉，雙城雀巢有限公司；白砂糖，廣西上上糖業(yè)有限公司；747型發(fā)酵劑，普爾斯(天津)國(guó)際貿(mào)易有限公司；Maxilact乳糖酶，Royal DSM公司。

Astree Ⅱ型電子舌、Heracles Ⅱ型電子鼻、DW-86L729型超低溫保存箱(-80 ℃)，法國(guó)Alpha M.O.S公司；EVO 18型掃描電子顯微鏡，德國(guó)卡爾蔡司公司；SC-15型數(shù)控超級(jí)恒溫槽、Scientz-50 N型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；MCR 301型流變儀，Physica公司，HunterLab測(cè)色儀，美國(guó)HunterLab公司；紫外分光光度計(jì)，HITACHI日立儀器公司；Bayer LactoMonitor乳糖測(cè)定儀，德國(guó)拜耳公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)乳糖酸奶的制作工藝

水預(yù)熱(50 ℃)→復(fù)原乳(全脂乳粉11.0%，白砂糖6.0%，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))→均質(zhì)(15 MPa)→熱處理→冷卻降溫(40 ℃)→接入發(fā)酵劑與乳糖酶→攪拌(10 min)→ 密封保溫發(fā)酵(42 ℃，6 h)→冷藏保存(4 ℃)

熱處理：分別采用65 ℃、30 min，75 ℃、15 min，85 ℃、10 min，95 ℃、5 min處理，普通酸奶生產(chǎn)中的熱處理?xiàng)l件為85 ℃、10 min。

發(fā)酵劑與乳糖酶：發(fā)酵劑添加量為0.06 g/kg，加酶量為2 500 U/g。

1.2.2 乳糖測(cè)定

取1 μL待測(cè)試樣置于乳糖儀試紙的電極上，等待5 s后讀數(shù)。

1.2.3 表觀黏度的測(cè)定

參照王松松等[10]的方法。采用MCR 301流變儀，取少量酸奶樣品于流變儀的測(cè)定平臺(tái)上，選取探頭為pp50，直徑25 mm的錐板，恒定溫度為25 ℃，測(cè)定樣品表觀黏度與剪切應(yīng)力在0～1 000 s-1過(guò)程中的變化。

1.2.4 滋味測(cè)定

參照馬長(zhǎng)路等[11]的實(shí)驗(yàn)方法，采用電子舌進(jìn)行分析。首先進(jìn)行預(yù)平衡、校準(zhǔn)，然后稱取 40.0 g酸奶樣品，用超純水進(jìn)行二倍稀釋后，置于電子舌專用測(cè)試杯中，進(jìn)行滋味的檢測(cè)和數(shù)據(jù)采集，每個(gè)酸奶樣品采集時(shí)間為 120 s，清洗時(shí)間為10 s，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試3次，進(jìn)行主成分分析和味覺(jué)強(qiáng)度分析。

1.2.5 氣味的測(cè)定

采用電子鼻對(duì)樣品的氣味進(jìn)行分析[12]。精確稱取7.0 g樣品于20 mL頂空瓶中，在45 ℃的條件下孵化20 min，振蕩速度為 500 r/min。進(jìn)樣量5 000 μL，注射速度125 μL/s。進(jìn)樣口溫度為200 ℃、壓力10 kPa、流速30 mL/min、注射時(shí)間45 s。采用正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行化合物標(biāo)定，利用化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)色譜圖相，以峰高和峰面積確定化合物與相對(duì)含量。

1.2.6 色度測(cè)定

使用HunterLab測(cè)色儀對(duì)酸奶樣品進(jìn)行色度分析[13]。先進(jìn)行黑板校準(zhǔn)，黑玻璃或黑光阱用于定反射率的底，然后用白板校準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)白板用于定反射率的頂。每個(gè)樣品取3個(gè)平行測(cè)定，其中L*，a*，b*可直接讀出，按照公式(1)計(jì)算ΔE值:

(1)

式中：L*，明度；a*，紅色度；b*，黃色度。

1.2.7 貯藏穩(wěn)定性的評(píng)定

1.2.7.1 懸浮穩(wěn)定性

取酸奶樣品3 g，稀釋80倍。在波長(zhǎng)540 nm處，測(cè)得樣品吸光度記為A1。然后取酸奶50 mL，于4 000 r/min離心10 min，取上層乳液，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)得吸光度記為A2。按公式(2)計(jì)算懸浮穩(wěn)定性，R值越大，說(shuō)明酸奶樣品的懸浮穩(wěn)定性越好[14]:

(2)

式中：R,酸奶穩(wěn)定性；A1,樣品吸光度；A2,離心后吸光度。

1.2.7.2 持水性

準(zhǔn)確稱取30 g酸奶樣品，在4 000 r/min離心15 min，靜置10 min后，棄去上清液，根據(jù)公式(3)計(jì)算樣品持水性[15]:

(3)

式中：m0，離心管質(zhì)量；m1，樣品質(zhì)量；m2，離心棄上清液后樣品質(zhì)量。

1.2.8 酸奶微觀結(jié)構(gòu)的評(píng)定

采用EVO 18掃描電子顯微鏡，對(duì)不同熱處理下的無(wú)乳糖酸奶的超微形貌特征進(jìn)行觀察，同時(shí)與普通酸奶對(duì)比。取一定量酸奶樣品，置于-18 ℃冰箱里，預(yù)凍7 h之后，在-80 ℃超低溫保存箱中冷凍4 h，取出后立即進(jìn)行24 h凍干，再將凍干的酸奶樣品鍍金膜，抽真空后，在10.0 kV電壓下進(jìn)行掃描電鏡測(cè)試[16]。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Origin 8.0和Excel作圖。電子鼻、電子舌的數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 23.0進(jìn)行單因素以及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶中乳糖含量分析

普通酸奶及不同溫度熱處理的無(wú)乳糖酸奶的乳糖殘留如表1所示。在添加乳糖酶的酸奶樣品中，乳糖殘留量低于0.5%達(dá)到了無(wú)乳糖的標(biāo)準(zhǔn)[17]。由于乳糖酶在熱處理完成后添加，所以不同的熱處理溫度對(duì)同一乳糖酶添加量的酸奶的乳糖殘留量沒(méi)有顯著影響。

表1 普通酸奶與不同熱處理無(wú)乳糖酸奶的乳糖殘留量Table 1 Lactose residue in normal yoghurt and lactose-free yoghurt with different heat treatment

2.2 不同熱處理溫度對(duì)無(wú)乳糖酸奶表觀黏度的影響

普通酸奶與無(wú)乳糖酸奶的表觀黏度和剪切速率關(guān)系均有著相似的趨勢(shì)(圖1)。當(dāng)剪切速率為0.03 s-1時(shí)，表觀黏度達(dá)到了最大值，隨著剪切速率的增加，表觀黏度隨之降低，無(wú)乳糖酸奶表觀黏度普遍高于普通酸奶。SKATARZYNA等[18]認(rèn)為,將乳糖分解成單糖可以改善酸奶的流變特性和黏度。95 ℃的無(wú)乳糖酸奶表觀黏度較高。其原因是乳清蛋白含有大量的二硫鍵和巰基，在加熱的過(guò)程中，β-乳球蛋白的球狀結(jié)構(gòu)打開，導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露，乳清蛋白會(huì)通過(guò)巰基和二硫鍵在分子層面上的交換，β-乳球蛋白形成聚集體，使得蛋白的網(wǎng)路更加緊密，從而提高無(wú)乳糖酸奶的表觀黏度[19]。另外，隨著剪切速率的增加，所有樣品的表觀黏度急劇下降，原因是高速的剪切會(huì)引起“搖溶”現(xiàn)象。因此，隨著剪切速率的增加，酸奶的表觀黏度顯著降低[20]。

圖1 普通酸奶與不同熱處理溫度下的無(wú)乳糖酸奶流變特性Fig.1 Rheological properties of normal yogurt and lactose-free yogurt at different heat treatment temperatures

2.3 不同熱處理溫度對(duì)無(wú)乳糖酸奶滋味的影響

通過(guò)主成分分析，普通酸奶和無(wú)乳糖酸奶之間的滋味有著顯著的差異(圖2)。在苦味、咸味、甜味方面，經(jīng)過(guò)熱處理的無(wú)乳糖酸奶要低于普通酸奶，這是因?yàn)闊o(wú)乳糖酸奶乳糖含量比普通酸奶低，與普通酸奶相比，美拉德反應(yīng)程度較小[21]。

圖2 普通酸奶與不同熱處理無(wú)乳糖酸奶滋味主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of taste of normal yogurt and lactose-free yogurt with different heat treatment

不同熱處理溫度對(duì)無(wú)乳糖酸奶的滋味有著比較顯著的影響。95 ℃條件下熱處理5 min的樣品酸味，甜味比較突出，但是鮮味不足(圖3)。綜合比較不同熱處理溫度下的樣品，溫度為75 ℃時(shí)，風(fēng)味表現(xiàn)最協(xié)調(diào)。

圖3 熱處理對(duì)普通酸奶與無(wú)乳糖酸奶滋味的影響Fig.3 Effect of heat treatment on the taste of normal yogurt and lactose-free yogurt

2.4 不同熱處理溫度對(duì)無(wú)乳糖酸奶氣味的影響

無(wú)乳糖酸奶和普通酸奶之間氣味沒(méi)有顯著性差異(圖4)。主要的揮發(fā)性香氣由丙酮、乙醛、2,3-丁二酮、2-丁酮等組成。在酸奶樣品中，丙酮強(qiáng)度較高，除了原料中含有丙酮外，乳酸菌代謝葡萄糖也會(huì)產(chǎn)生丙酮。2,3-丁二酮具有奶香味，且風(fēng)味閾值較低，低濃度的2,3-丁二酮能夠賦予酸奶奶油的香味[22]，OTT等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，在牛乳的發(fā)酵過(guò)程中，乙醛和丁二酮等物質(zhì)的含量顯著增加，賦予了酸奶獨(dú)特的風(fēng)味。普通酸奶和無(wú)乳糖酸奶風(fēng)味沒(méi)有顯著性差異，原因也是由于主要的風(fēng)味物質(zhì)受乳糖的影響較小。

圖4 普通酸奶與無(wú)乳糖酸奶氣味對(duì)比Fig.4 Comparison of odor between ordinary yoghurt and lactose-free yogurt注：圖中普通酸奶譜圖由實(shí)際值取相反數(shù)得到

在氣味上，不同溫度處理的無(wú)乳糖酸奶無(wú)顯著性差異(圖5)，主要風(fēng)味也是由丙酮、乙醛、2,3-丁二酮、2-丁酮貢獻(xiàn)。

圖5 不同熱處理溫度下的無(wú)乳糖酸奶氣味對(duì)比Fig.5 Odor comparison of lactose-free yoghurt under different heat treatment temperatures

2.5 不同熱處理溫度對(duì)無(wú)乳糖酸奶色度的影響

無(wú)乳糖酸奶與普通酸奶之間色差無(wú)顯著差別(表2)，不同的熱處理溫度也對(duì)無(wú)乳糖酸奶的色差沒(méi)有顯著的影響，其原因是熱處理時(shí)間較短，美拉德反應(yīng)最終階段產(chǎn)生的類黑精積累較少[24]。乳糖對(duì)酸奶顏色的貢獻(xiàn)程度較低，這也使得無(wú)乳糖酸奶和普通酸奶色度上差別不大。由于處理時(shí)間較短，不同熱處理溫度的無(wú)乳糖酸奶在色度上沒(méi)有顯著性差別。

表2 不同熱處理溫度對(duì)無(wú)乳糖酸奶色度的影響Table 2 Effect of different heat treatment on color of lactose free yoghurt

2.6 不同熱處理溫度對(duì)無(wú)乳糖酸奶貯藏穩(wěn)定性的影響

無(wú)乳糖酸奶與普通酸奶相比，無(wú)乳糖酸奶的持水性和懸浮穩(wěn)定性較好(圖6)，原因是乳糖在乳糖酶的作用下分解成葡萄糖和半乳糖，半乳糖屬于胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)[25]。根據(jù)KRUIF等[26]的報(bào)道，如果胞外多糖的含量不能完全覆蓋蛋白時(shí)，一個(gè)胞外多糖可以連接在幾個(gè)蛋白表面，從而發(fā)生復(fù)凝聚。因此，酶解無(wú)乳糖酸奶的穩(wěn)定性要優(yōu)于普通酸奶。

a-普通酸奶與無(wú)乳糖酸奶的持水性比較；b-普通酸奶與無(wú)乳糖酸奶的懸浮穩(wěn)定性比較圖6 普通酸奶與無(wú)乳糖酸奶的貯藏穩(wěn)定性Fig.6 Storage stability of plain yogurt and lactose-free yogurt

隨著熱處理溫度的上升，無(wú)乳糖酸奶的持水性增加(圖7)，懸浮穩(wěn)定性總體上也是隨著溫度的增加而增加。其原因是，當(dāng)熱處理溫度升高時(shí)，乳清蛋白由于發(fā)生多肽鏈的去折疊導(dǎo)致變性，使結(jié)構(gòu)內(nèi)部的側(cè)鏈基團(tuán)暴露，使其與酪蛋白發(fā)生交聯(lián)[27]，因此，熱處理溫度高的無(wú)乳糖酸奶持水性和懸浮穩(wěn)定性增加。

圖7 不同熱處理溫度下無(wú)乳糖酸奶的貯藏穩(wěn)定性Fig.7 Storage stability of lactose-free yogurt under different heat treatment

2.7 不同熱處理溫度對(duì)無(wú)乳糖酸奶微觀結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)掃描電鏡可以觀察無(wú)乳糖酸奶和普通酸奶放大12 000倍后的微觀結(jié)構(gòu)(圖8)，無(wú)乳糖酸奶的微觀結(jié)構(gòu)比普通酸奶更加致密，這個(gè)結(jié)果能較好地佐證無(wú)乳糖酸奶比普通酸奶有著更好的表觀黏度和貯藏穩(wěn)定性。

a-85 ℃,10 min熱處理下普通酸奶；b-85 ℃,10 min熱處理下無(wú)乳糖酸奶圖8 普通酸奶與無(wú)乳糖酸奶掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron micrographs of plain yogurt and lactose free yogurt

不同熱處理無(wú)乳糖酸奶掃描電鏡(×12 000)如圖9所示，熱處理溫度越高，樣品的結(jié)構(gòu)也越來(lái)越致密，微觀結(jié)構(gòu)的改變對(duì)酸奶宏觀特性有顯著影響。經(jīng)過(guò)65 ℃、30 min熱處理的酸奶形成的凝膠呈現(xiàn)出含有較大酪蛋白顆粒的彎曲狀團(tuán)聚網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，是因?yàn)闊崽幚頊囟炔桓邥r(shí)，乳清蛋白變性程度小，變性的乳球蛋白結(jié)合在酪蛋白上，呈現(xiàn)不規(guī)則的鏈球狀，有著比較高的表面疏水性。經(jīng)過(guò)75 ℃、15 min，85 ℃、10 min熱處理的酸奶凝膠的團(tuán)聚網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得緊密。經(jīng)過(guò)95 ℃、5 min熱處理的酸奶凝膠結(jié)構(gòu)變得幾乎沒(méi)有空隙，這是由于熱處理溫度得到增加，α-乳白蛋白開始變性，覆蓋在乳球蛋白上，使得表面越來(lái)越光滑，疏水性降低，增加了蛋白質(zhì)的持水性[28]。

a-65 ℃,30 min熱處理下無(wú)乳糖酸奶；b-75 ℃,15 min熱處理下無(wú)乳糖酸奶；c-85 ℃,10 min熱處理下無(wú)乳糖酸奶；d-95 ℃,5 min熱處理下無(wú)乳糖酸奶圖9 不同熱處理溫度的無(wú)乳糖酸奶掃描電鏡圖Fig.9 Scanning electron micrographs of lactose free yoghurt with different heat treatment temperatures

3 結(jié)論

在乳糖酶的作用下，酸奶中胞外多糖的含量增加，提高了酸奶的表觀黏度和穩(wěn)定性。同時(shí)，不同熱處理溫度會(huì)對(duì)無(wú)乳糖酸奶的宏觀特性及微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。滋味上，無(wú)乳糖酸奶在苦味、咸味、甜味上要低于普通酸奶，經(jīng)過(guò)75 ℃、15 min熱處理的無(wú)乳糖酸奶風(fēng)味表現(xiàn)最為協(xié)調(diào)；不同熱處理的無(wú)乳糖酸奶與普通酸奶之間在氣味和色度表現(xiàn)上無(wú)顯著性差異。隨著熱處理溫度的上升，酸奶持水性與懸浮穩(wěn)定性也隨之增加。溫度上升導(dǎo)致酸奶凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)交聯(lián)度更大、更致密，孔隙變得更小，有利于持水。由于美拉德反應(yīng)的存在，過(guò)高的溫度對(duì)無(wú)乳糖酸奶的滋味產(chǎn)生影響。綜合比較，無(wú)乳糖酸奶最佳熱處理?xiàng)l件為75 ℃、15 min。該結(jié)論對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。