鄭 威， 盧 嬋， 余 侃， 黃思思， 余錦平 ， 劉金龍 ， 程水源，魏金濤， 李良華， 劉欋霄， 鄭 倬， 田國政， 周光來

（1.湖北省農業(yè)科學院農業(yè)經濟技術研究所，湖北武漢430064；2.湖北民族大學生物科學與技術學院，湖北恩施445000；3.武漢輕工大學國家富硒農產品加工技術研發(fā)專業(yè)中心，湖北武漢430023；4.湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢430064；5.湖北華龍西科生物科技有限公司，湖北英山438700）

黃曲霉毒素（AFB1）是飼料中毒性最為強烈的毒素成分，其破壞機體免疫機能，降低生豬疾病的抵抗能力和生長速度。 AFB1蓄積在豬肉中，降低了豬肉安全性和品質，損害人和動物的肝臟，甚至引起動物癌變致死（周芬等，2019a、2019b；張帆等，2018）。 生豬飼料在原料生產和儲放過程中易被黃曲霉侵染。 我國GB 13078-2001 規(guī)定仔豬配合飼料及濃縮飼料和生育肥豬、種豬配合飼料及濃縮飼料的AFB1最高限量分別是10、20 μg/kg，有研究證明飼料存放35 d，AFB1含量為20.8 μg/kg，超過濃縮料毒素限量標準， 甚至最高達到239.97 μg/kg（白龍律等，2020；姜翠翠等，2008）。

目前已有用益生菌（李雯等，2020； 彭俊等，2020； 張 波，2020；Chang 等，2020； 胡 永 婷 等，2019；楊桂林等，2019；張銘，2019）、臭氧（Torlak等，2016）、低溫射頻等離子體（李玉鵬等，2014）、常壓等離子體（任翠榮等，2017）、超高壓輔助酶法（林奕云等，2019）、輻照（王守經等，2015）、微波（靳志強等，2011）、脈沖強光、紫外和紅外輻射（王蓓等，2014）等技術分別對降解AFB1進行了小試研究報道，但都沒有進入中試批量生產。本研究使用先進的中試固體發(fā)酵系統(tǒng)設備和益生菌發(fā)酵技術進行單因素設計試驗， 并采用響應面分析軟件優(yōu)化發(fā)酵降解豬飼料AFB1最佳生產工藝參數(shù)，旨在形成比較成熟的豬飼料AFB1達標中試生產線和生產技術，再經過大生產前的生產參數(shù)調試，滿足大中小養(yǎng)豬場機械化、 低成本生產AFB1達標的豬飼料。

1 材料與方法

1.1 儀器設備與材料

1.1.1 儀器設備 T200 型固體發(fā)酵罐體系統(tǒng)設備（上海洋格生物工程設備有限公司）、JC-280 量子波發(fā)生器（中健量子科技有限公司）、TS-211GZ搖床、DN900×1500 mm 高壓鍋、SW-CJ-1F 超凈工作臺、OZ-2003 臭氧機、1290-6530 生化-63-液相-質譜聯(lián)用儀。

1.1.2 材料 益生菌1 號菌CCTCC NO.M2016298，2 號 菌CGMCC NO.17328，3 號 菌CGMCC NO.15611， 供試飼料為市售配合飼料，AFB1標準品（北京畢特博生物技術有限責任公司）， 純度99.9%亞硒酸鈉（無機硒，Se4+，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 AFB1含量分析方法 使用1290-6530 生化-63-液相-質譜聯(lián)用儀， 按NY/T 2017 檢測要求檢測AFB1含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件 單因素數(shù)據(jù)處理軟件Origin8.5，響應面數(shù)據(jù)處理軟件Design-expert V8.0.6。

1.4 單因素發(fā)酵降解AFB1工藝設計

1.4.1 硒濃度對降解AFB1量的影響 配制AFB1濃度為60 μg/kg 的牛肉膏液體培養(yǎng)基2 L， 置滅菌小試用發(fā)酵罐，設置發(fā)酵溫度32 ℃，1 號菌種，量子波強度15 Hz，發(fā)酵時間24 h，硒濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/kg，接菌種發(fā)酵培養(yǎng)。1.4.2 發(fā)酵時間對降解AFB1量的影響 配制AFB1濃度為60 μg/kg 的牛肉膏液體培養(yǎng)基2 L，置滅菌小試用發(fā)酵罐， 設置發(fā)酵溫度32 ℃，1 號菌種，量子波強度15 Hz，硒濃度0.3 mg/kg，設置發(fā)酵時間分別為0、3、6、9、12、15、18、21、24 h，接菌種發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4.3 量子波強度對降解AFB1量的影響 配制AFB1濃度為60 μg/kg 的牛肉膏液體培養(yǎng)基2 L，置滅菌小試用發(fā)酵罐， 設置發(fā)酵溫度32 ℃，1 號菌種，硒濃度0.3 mg/kg，發(fā)酵時間24 h，量子波強度分別為0、5、10、15、20、25、30、35 Hz，接菌種發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4.4 菌種組合對降解AFB1量的影響 配制AFB1濃度為60 μg/kg 的牛肉膏液體培養(yǎng)基2 L，置滅菌小試用發(fā)酵罐，設置發(fā)酵溫度32 ℃，硒濃度0.3 mg/kg，量子波強度15 Hz，發(fā)酵時間24 h，設置菌種分別為0 號菌種 （無菌種）、1 號菌種、2號菌種、3 號菌 種、1 號菌種+2 號 菌種組合、1 號菌種+3 號菌種組合、2 號菌種+3 號菌種組合、1號菌種+2 號菌種+3 號菌種組合，接菌種發(fā)酵培養(yǎng)。

1.5 響應面法降解AFB1量工藝 根據(jù)單因素試驗結果，以硒濃度、發(fā)酵時間、量子波強度和菌種組合為自變量， 飼料含AFB1量為響應值， 根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗設計原理， 采用響應面法在四因素三水平下對發(fā)酵工藝參數(shù)進行優(yōu)化（表1）。 根據(jù)模型分析試驗結果，確定最佳降解AFB1量的工藝條件。

表1 響應面設計因素與水平

2 結果與分析

2.1 單因素對降解豬飼料AFB1量的影響

2.1.1 硒濃度對降解豬飼料AFB1量的影響 豬飼料原料AFB1量為60.15 μg/kg，經過量子波處理和益 生菌CCTCC NO.M2016298 發(fā)酵，AFB1量降解至26.05 μg/kg（圖1）。依次加入亞硒酸鈉的純硒0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/kg， 豬飼料AFB1量逐步降低。 說明硒具有增強益生菌降解AFB1的效果。 但隨著加硒量增加，豬飼料AFB1量減少不顯著，當硒濃度達到0.4 mg/kg 后， 再增加硒濃度， 其豬飼料AFB1量不再減少。 推測無機硒（Se4+）在降解AFB1的量時有一個臨界值，超過這個臨界值，再增加硒濃度，AFB1不再降解。 說明使用硒濃度0.4 mg/kg時，可最大限度促進枯草芽孢桿菌發(fā)酵活性和發(fā)揮其最大的降解豬飼料AFB1的能力。

圖1 硒濃度對降解豬飼料AFB1 量的影響

2.1.2 發(fā)酵時間對降解豬飼料AFB1量的影響豬飼料原料AFB1量為60.15 μg/kg， 經過量子波處理、接種益生菌CCTCC NO.M2016298，逐步增加發(fā)酵時間， 豬飼料AFB1量依次降解至58.93、54.98、48.85、40.67、31.37、14.16、12.42、12.07 μg/kg，增加發(fā)酵時間可顯著降解豬飼料AFB1量（圖2）。當發(fā)酵21 h 后，再增加發(fā)酵時間，降解AFB1效果不明顯，這與枯草芽孢桿菌在發(fā)酵21 h 左右結束發(fā)酵的微生物種性有關。

圖2 發(fā)酵時間對降解豬飼料AFB1 量的影響

2.1.3 量子波強度對降解豬飼料AFB1量的影響添加硒濃度0.3 mg/kg， 用益生菌CCTCC NO.M2016298 發(fā)酵24 h，隨著量子波強度增加，豬飼料AFB1量逐步降低，使用量子波處理后，豬飼料AFB1量降低28.49 μg/kg。 在5 ～30 Hz 內，隨量子波強度增大，豬飼料AFB1量顯著降低，量子波強度高于35 Hz，則豬飼料AFB1含量不降反而略升（圖3）。 推測量子波強度低于30 Hz，可充分激活枯草芽孢桿菌降解豬飼料AFB1的能力； 量子波強度高于35 Hz， 則抑制枯草芽孢桿菌降解AFB1的能力。

圖3 量子波強度對降解豬飼料AFB1 量的影響

2.1.4 菌種組合對降解豬飼料AFB1量的影響分別接種0 號菌種（無菌種）、1 號菌種、2 號種菌、3 號菌種、1 號菌種+2 號菌種組合、1 號菌種+3 號菌種組合、2 號菌種+3 號菌種組合、1 號菌種+2號菌種+3 號菌種組合進行發(fā)酵。加入益生菌后的豬飼料AFB1量明顯降低。 2 號菌種+3 號菌種組合降解豬飼料AFB1量的效果最明顯。1 號菌種+2號菌種+3 號菌種組合其次（圖4）。 說明不同的枯草芽孢桿菌種和不同的枯草芽孢桿菌種組合發(fā)酵降解豬飼料AFB1有較大差異， 推測與某些菌種間存在拮抗有關。

圖4 菌種組合對降解豬飼料AFB1 量的影響

豬飼料原料AFB1量為60.15 μg/kg，0 號菌種（不接菌種）處理的豬飼料AFB1量比未發(fā)酵前提高了9.71 μg/kg，這說明，只有硒、量子波而沒有益生菌存在下，隨著時間的推移，豬飼料AFB1量略有提高，因此有效降低AFB1超標豬飼料必須使用具有顯著降解AFB1能力的益生菌，結合硒、量子波、發(fā)酵時間等因素協(xié)同增強降解AFB1的效果。

2.2 響應面試驗設計及結果 在單因素試驗結果基礎上，以硒濃度、發(fā)酵時間、量子波強度和菌種組合為自變量，豬飼料含AFB1量為響應值，進行響應面分析試驗。 試驗結果如表2 所示。

2.3 響應面回歸模型及方差分析 根據(jù)表2 進行多元回歸擬合和方差分析，結果如表3 所示。

四個因素經過擬合的二次多項回歸模型方程為：Y =24.37 -0.69A -20.79B -9.64C -2.81D -0.92AB +0.11AC +0.038AD -4.88BC -0.31BD +4.88CD+0.18A2+13.59B2-3.64C2-2.26D2。 模型P＜0.0001，具有高度的顯著性，模型失擬項P=0.088＞0.05，不顯著，證明建模成功，試驗結果可用該模型描述。 模型的決定系數(shù)R2=0.9796，說明響應值的變化有97.96%來源于所選因素，該模型與實際情況接近，試驗擬合程度良好，誤差小，能充分反映各因素與響應值間的關系。

發(fā)酵時間、量子波強度的一次項，發(fā)酵時間的二次項達到極顯著水平（P＜0.0001）；菌種組合的一次項、量子波強度的二次項、量子波強度與菌種組合的交互作用和發(fā)酵時間與量子波強度交互作用達到顯著水平（P＜0.05）；說明各因素對響應值的影響較為復雜，不是簡單的線性關系，而應是拋物面關系。 根據(jù)各因素F 值的大小可知，各因素對降解豬飼料AFB1量的能力影響的大小順序為：發(fā)酵時間＞量子波強度＞菌種組合＞硒濃度。

2.4 因素間交互作用分析 響應曲面坡度越彎曲，則響應值對于因素的改變越敏感，相反曲面越平緩，則響應值對于因素的改變越遲鈍；等高線圖形狀反映交互作用的強弱， 等高線圖形越橢圓，表示交互作用越顯著。 圖5 ～圖10 直觀地給出了各個因素交互作用響應面的3D 和等值線分析圖。從圖上可知，BC、CD 即發(fā)酵時間與量子波強度、 量子波強度與菌種組合交互項對響應值的影響顯著， 這與模型的方差分析結果一致。

2.5 最佳工藝條件 根據(jù)擬合模型方程，結合等高線和響應面，得出降低豬飼料AFB1量的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：硒濃度0.3 mg/kg，發(fā)酵時間20 h，量子波強度30 Hz 和2 號菌CGMCC NO.17328與3 號菌CGMCC NO：15611 組合，可將豬飼料中的AFB1從63.41 μg/kg 降解到2.98 μg/kg， 降解率達到95.30%。

2.6 產品質量指標

2.6.1 感官指標 發(fā)酵豬飼料，沒有異味。

2.6.2 微生物指標 枯草芽孢桿菌和芽孢桿菌≥1×106cfu/mL，霉菌、酵母菌、致病菌未檢出，符合GB/T 4789.35-2016 相關要求。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 回歸模型及方差分析

圖5 硒濃度和發(fā)酵時間交互作用的等高線圖與響應面

圖6 硒濃度和量子波強度交互作用的等高線圖與響應面

圖7 硒濃度和菌種組合交互作用的等高線圖與響應面

圖8 發(fā)酵時間和量子波強度交互作用的等高線圖與響應面

圖9 發(fā)酵時間和菌種組合交互作用的等高線圖與響應面

圖10 量子波強度和菌種組合交互作用的等高線圖與響應面

3 結論與討論

本試驗結果表明， 影響降解豬飼料AFB1量的因素大小順序為：發(fā)酵時間＞量子波強度＞菌種組合＞硒濃度。 優(yōu)化的降解豬飼料AFB1量的最佳工藝條件為：硒濃度0.3 mg/kg，發(fā)酵時間12 h，量子波強度30 Hz 和菌種組合益生菌CGMCC NO：17328 混合CGMCC NO：15611。 可將豬飼料AFB1量從63.41 μg/kg 降解到2.98 μg/kg，降解率達到95.30%。 量子波強度與菌種組合的交互作用和發(fā)酵時間與量子波強度在降解AFB1的交互作用達到顯著水平。發(fā)酵時間和量子波強度在降解AFB1達到極顯著水平。

在本研究響應面里，3 種菌種組合既是3 個水平又是3 個因素，不同菌種、不同菌種組合，降解AFB1的效果不同，不同菌種組合降解AFB1的疊加效果差異較大，略有影響變異系數(shù)，但證明不同益生菌組合降解AFB1效果有差異。 在本研究響應面里， 無機硒 （Se4+） 可提高益生菌活性，從而提高降解豬飼料AFB1的效果，但達不到顯著水平。