覃 婷 田 矛 李友瓊 龍喜貴 張秀群

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷中心，南寧市 530021，電子郵箱：2278919254@qq.com)

間隙連接蛋白β2(gap junction protein beta 2,GJB2)基因位于13號(hào)染色體q12.11,含2個(gè)外顯子，編碼β2縫隙連接蛋白，在內(nèi)耳毛細(xì)胞及皮膚組織中高度表達(dá)，與其他縫隙連接蛋白家族成員在細(xì)胞膜上裝配形成細(xì)胞間連接通道，與細(xì)胞間的信號(hào)連接通路及離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)[1]。GJB2基因突變可導(dǎo)致遺傳性耳聾。本研究采用Sanger測序法檢測普通人群的GJB2基因編碼區(qū)，了解其主要突變類型。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 于2016年招募無明顯聽力障礙表現(xiàn)的200例志愿者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)研究對(duì)象之間3代之內(nèi)無血緣關(guān)系；(2)同意參加本研究并簽署知情同意書；(3)無日常生活中可觀察到的聽力障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：1年之內(nèi)輸血史或干細(xì)胞治療病史。其中男性69例、女性131例，年齡為18～35(23.43±4.48)歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集 采集2 mL外周血，使用華生生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒提取外周血白細(xì)胞DNA。

1.3 基因檢測 將提取的DNA外送至成都博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，使用Sanger測序法測定所有樣本的GJB2基因編碼區(qū)。引物序列為：GJB2-A-F 5′TGCTTGCTTACCCAGACTCAG-3′,GJB2-A-R 5′TGGGTTTTGATCTCCTCGATG-3′；GJB2-B-F 5′GCCTACCGGAGACATGAGAAG-3′,GJB2-B-R 5′ GCGACTGAGCCTTGACAGCT-3′。在94℃，1 min→(98℃，10 s→60℃，30 s→72℃，40 s)×30個(gè)循環(huán)→72℃，10 min→10℃條件下擴(kuò)增GJB2基因編碼區(qū)域，產(chǎn)物無需純化。根據(jù)ABI 3100測序儀使用手冊，使用ABI 3100測序儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，采用ABI 3100分析軟件(3.7NT版)分析測序結(jié)果，與NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中人類GJB2基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，判讀單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)及InDel位點(diǎn)。

1.4 突變位點(diǎn)臨床意義的判讀 通過2019年12月19日更新的Version:8.2.1版Deafness variation Database數(shù)據(jù)庫(http://deafnessvariationdatabase.org/)，進(jìn)行突變位點(diǎn)臨床意義判讀。

2 結(jié) 果

200例志愿者中，共84例檢出GJB2基因突變(見表1)。共有9種變異體，其中2種為缺失所致移碼突變，包括c.235delC、c.299-300delAT；7種為錯(cuò)義突變，包括良性變異4種(c.79G>A、c.341A>G、c.11G>A、c.608T>C)和致病性錯(cuò)義變異3種(c.109G>A、c.557C>T、c.139G>T)。 各種變異體數(shù)量及其基因頻率見表2。

表1 84例GJB2基因突變者的檢測結(jié)果

表2 GJB2基因突變位點(diǎn)及基因頻率

3 討 論

耳聾基因GJB2全長12513 bp，含2個(gè)外顯子，其中編碼序列全長681 bp，位于2號(hào)外顯子，僅有1個(gè)開放讀碼框。Sanger測序可以準(zhǔn)確檢測單個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、缺失或插入，發(fā)現(xiàn)已知突變及未知突變位點(diǎn)，可用于檢測GJB2基因編碼序列的突變[2]。依據(jù)對(duì)蛋白產(chǎn)物的影響，堿基的突變可分為錯(cuò)義突變、移碼突變、無義突變等。本研究共檢出兩種缺失所致的致病性移碼突變c.235delC、c.299-300delAT，基因頻率分別為0.50%、0.25%，與高敏等[3]在孕婦中檢測到的基因頻率(分別為0.95%、0.23%)基本一致，也與聞小慧等[4]在孕婦中檢出的基因頻率(分別為1%、0.43%)相仿。這提示，c.235delC、c.299-300delAT可能是我國普通人群GJB2基因較常見的堿基缺失所致致病性突變。

c.109G>A為最常見的錯(cuò)義突變，37位上的纈氨酸被同為疏水氨基酸的異亮氨酸取代，長期以來其致病性存在較多爭議。王現(xiàn)蕾等[5]對(duì)41例c.109G>A復(fù)合致病性移碼突變的兒童進(jìn)行聽力學(xué)評(píng)估，約60%的兒童出現(xiàn)輕至中度耳聾。Shen等[6]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，c.109G>A純合子或與其他致病位點(diǎn)構(gòu)成復(fù)合雜合突變者出現(xiàn)聽力損失的風(fēng)險(xiǎn)高于野生型。Lin[7]等在c.109G>A突變小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳毛細(xì)胞周圍鉀離子蓄積導(dǎo)致對(duì)環(huán)境因素易感，可能是小鼠進(jìn)展性聽力下降的原因。ClinVar數(shù)據(jù)庫于2019年4月24日將c.109G>A變體歸類于致病性錯(cuò)義突變。在1000 Genomes Browsers數(shù)據(jù)庫中這個(gè)位點(diǎn)有顯著種族差異，在歐美人及非洲黑人中基因頻率極低，日本東京人群基因頻率為1.44%，北京漢族人群為3.88%，南方漢族人群為6.67%，而在西雙版納傣族人群中為17.20%。在未區(qū)分民族的情況下，本研究的200例無明顯聽力障礙者中c.109G>A基因頻率為13.50%，高于1000 Genomes Browser發(fā)布的南方漢族基因頻率，不除外樣本偏倚所致，須后續(xù)增加樣本量進(jìn)一步分析。本研究在無明顯聽力障礙的人群中共檢出10例c.109G>A純合子，后續(xù)對(duì)其進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，其中1例(35歲)在3年間出現(xiàn)40 dB的聽力下降，現(xiàn)為輕度耳聾，7例未發(fā)現(xiàn)聽力障礙，其余2例失訪。c.109G>A純合突變者較少發(fā)生語前聾，但該突變?yōu)檎Z后聾遺傳易感高危因素，輕度的聽力障礙容易被忽視[8]，因此需要加強(qiáng)c.109G>A純合突變的隨訪，定期進(jìn)行聽力學(xué)檢測，了解年齡相關(guān)性及聽力學(xué)特點(diǎn)，以指導(dǎo)遺傳咨詢及聽力保健。

李朔等[9]利用耳聾基因芯片對(duì)孕婦進(jìn)行GJB2基因突變篩查以降低耳聾出生缺陷，但發(fā)現(xiàn)約有1 ∶16 000漏篩GJB2基因相關(guān)耳聾的殘余風(fēng)險(xiǎn)，這是因?yàn)樵撔酒瑑H能設(shè)計(jì)4個(gè)致病位點(diǎn)，即c.235delC、c.299-300delAT、c.176del16、c.35delG。而本研究檢出的c.139G>T、c.557G>T為罕見突變位點(diǎn)，未設(shè)計(jì)在芯片中，同時(shí)檢出的c.109G>A突變位點(diǎn)因高度外顯不全及多數(shù)純合子僅表現(xiàn)為語后聾的遺傳易感性，也不作為產(chǎn)前診斷預(yù)防耳聾出生缺陷的指征。由此可見，針對(duì)常見位點(diǎn)的孕婦耳聾基因篩查，在預(yù)防GJB2基因所致遺傳性耳聾患兒出生方面存在技術(shù)局限。

c.79G>A導(dǎo)致27位上的異亮氨酸取代纈氨酸，c.341A>G導(dǎo)致114位上的帶負(fù)電荷的谷氨酸被中性的甘氨酸取代，均為常見錯(cuò)義突變。本研究中，有3例攜帶3種突變位點(diǎn)，其中2例攜帶c.79G>A、c.341A>G、c.109G>A雜合子，1例攜帶 c.79G>A、c.341A>G、c.557C>T雜合子，提示其中至少有2個(gè)位點(diǎn)在基因中順式存在，由于未行雙親檢測而無法判定位點(diǎn)之間的相互關(guān)系。

此外，本研究中有 4例研究對(duì)象為c.79G>A、c.341A>G復(fù)合純合子，經(jīng)隨訪未見聽力異常，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，判讀c.79G>A與c.341A>G為良性錯(cuò)義突變。c.79G>A、c.341A>G基因頻率分別為10.00%與8.25%，可歸于編碼區(qū)域的非同義SNP。值得注意的是，本研究中未檢出獨(dú)立存在的c.341A>G突變，33個(gè)c.341A>G突變均與c.79G>A突變同時(shí)出現(xiàn)。假設(shè)c.341A>G與c.79G>A反式存在，隨機(jī)排列組合，c.341A>G復(fù)合c.79G>A的發(fā)生率應(yīng)為0.825%，但本研究檢出c.341A>G復(fù)合c.79G>A的發(fā)生率為14.5%(29/200)，提示c.341A>G與c.79G>A為順式關(guān)系。王棟等[10]對(duì)馬鞍山地區(qū)的耳聾人群基因進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn)，c.79G>A與c.341A>G存在較弱的連鎖不平衡。Shinagawa等[11]對(duì)GJB2基因c.235delC、c.299-300delAT、c.109G>A上下游位點(diǎn)構(gòu)建SNP單倍體型，通過連鎖不平衡分析后認(rèn)為，上述位點(diǎn)均起源于奠基者效應(yīng)并推算了大致起源時(shí)間,解釋了GJB2突變的種族特異性及區(qū)域分布差異。由此可見，c.341A>G可能起源于攜帶c.79G>A突變個(gè)體的奠基者效應(yīng)，這兩個(gè)非同義SNP在不同種族及人群中的差異性有待研究。

綜上所述，普通人群中GJB2基因以錯(cuò)義突變?yōu)橹?，c.109G>A在普通人群中有較高攜帶率，部分純合子可無聽力障礙。將針對(duì)已知突變熱點(diǎn)的篩查用于出生缺陷預(yù)防，存在一定的漏篩風(fēng)險(xiǎn)，在檢測前遺傳咨詢時(shí)需謹(jǐn)慎。