馬蘭紅 白 玲 李奇鳳

(新疆兒童醫(yī)院1 兒科，2 科教科，烏魯木齊市 830000，電子郵箱；xingbabke@163.com)

支氣管哮喘是多種炎癥細(xì)胞(如肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等)，以及多種炎癥因子參與的慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病，其特征是發(fā)生氣道高反應(yīng)性[1]。兒童支氣管哮喘的特點(diǎn)是起病急、癥狀重，病情不易控制，如病情長(zhǎng)期遷延可導(dǎo)致哮喘反復(fù)發(fā)作，不利于兒童生長(zhǎng)發(fā)育[2]。因此，深入研究支氣管哮喘的發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制，有助于尋找評(píng)估哮喘嚴(yán)重程度的指標(biāo)及有效的治療藥物。支氣管哮喘的病理生理表現(xiàn)為支氣管局部大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且伴有大量炎癥因子的釋放，如Th1型細(xì)胞可產(chǎn)生γ-干擾素，而Th2型細(xì)胞能夠分泌白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4及IgE，IgE誘導(dǎo)肥大細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒，進(jìn)而釋放組胺等介質(zhì)，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性[3]。此外，炎癥因子還可刺激氣道平滑肌細(xì)胞增生肥大及氣道纖維化等，引起氣道重塑及氣道狹窄的發(fā)生。解整合素-金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)33基因位于20p13，該基因編碼13個(gè)外顯子，編碼的蛋白屬于ADAM家族成員，具有ADAM家族共有的一個(gè)解體蛋白和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域。ADAM33是膜錨定蛋白，參與了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的各種生物過程，如受精、肌肉發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生等生理過程，以及腫瘤、炎癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。近年來有研究顯示，ADAM33基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與支氣管哮喘的易感性有關(guān)，其參與了支氣管哮喘中氣道高反應(yīng)性的發(fā)生[6]。本研究通過檢測(cè)支氣管哮喘患兒血漿ADAM33 rs678881及rs2853209基因SNP，以及血漿γ-干擾素、IL-4、IgE的表達(dá)水平，分析ADAM33 rs678881及rs2853209與兒童支氣管哮喘的易感性及其與γ-干擾素、IL-4、IgE的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月至2019年2月期間于我院兒科門診診治的238例支氣管哮喘患兒作為哮喘組，其中男性115例、女性123例，年齡2～14(6.2±2.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為初次診治，支氣管哮喘診斷均符合《兒童哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]；(2)患兒1月內(nèi)無呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等感染性疾病發(fā)生；(3)無嚴(yán)重心臟及其他肺部等疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物的患兒；(2)合并過敏性紫癜等其他免疫性疾病的患兒；(3)患兒家屬拒絕參加本研究。以同期進(jìn)行健康體檢的160例兒童作為對(duì)照組，其近1個(gè)月均無感染性疾病病史、無合并免疫性疾病或糖皮質(zhì)激素用藥史、無嚴(yán)重心肺疾病。其中男性88例、女性72例，年齡1～14(6.3±2.5)歲。哮喘組和對(duì)照組兒童的性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過。

1.2 觀察指標(biāo)的檢測(cè)

1.2.1 標(biāo)本的獲取及處理：取兩組兒童晨起空腹靜脈血約4 mL，乙二胺四乙酸抗凝，其中2 mL全血用于提取外周血DNA，另外2 mL標(biāo)本在4℃條件下2 000 r/min離心10 min分離血漿，用于檢測(cè)血漿中γ-干擾素、IL-4、IgE水平。

1.2.2 ADAM33基因rs678881及rs2853209的SNP檢測(cè)：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒(日本Takara公司，批號(hào)：KA5801CA)提取外周血DNA，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。應(yīng)用NaroDrop2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛公司)檢測(cè)DNA的濃度及純度，核酸電泳鑒定其完整性，置于-20℃冰箱保存。ADAM33 rs678881上游引物5′-TTCAAAGCCTCCCCCTCTCATC-3′，下游引物5′-TGATCCAGGAAAAGCCACAGC-3′；ADAM33 rs2853209上游引物5′-AGGGTGAGGCAGCCAGCT-3′，下游引物5′-CTTCCTCAGTGGCCTCCCAGTCAATCG-3′。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR總反應(yīng)體系25 μL，包括模板DNA 0.2 mg，上下游引物各0.1 μmoL，12.5 mL PCR Master，雙蒸水補(bǔ)足體系。PCR程序?yàn)樵?5℃下預(yù)變性3 min，94℃下變性30 s，60℃下退火45 s，72℃下延伸30 s，72℃延伸7 min，共45個(gè)循環(huán)。限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)總體體系10 μL，包括PCR產(chǎn)物8 μL，核酸限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ)2 U，雙蒸水補(bǔ)足體系。酶切反應(yīng)條件為37℃水浴4 h。產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，鑒定基因型。

1.2.3 血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的檢測(cè)：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿中γ-干擾素、IL-4、IgE水平，試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab46025、ab215089、ab108650)，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行 。

1.3 記錄哮喘組的并發(fā)癥發(fā)生情況 觀察支氣管哮喘患兒的消化道反應(yīng)(包括腹痛腹瀉、消化道出血、糞便隱血實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性)、縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭、心律失常、腎炎等并發(fā)癥的發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic回歸模型計(jì)算比值比(odds ratio,OR)以分析ADAM33基因rs678881、rs2853209位點(diǎn)各基因型、等位基因與兒童支氣管哮喘易感性的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADAM33 rs678881、rs2853209基因型和等位基因的分布及其與支氣管哮喘易感性關(guān)系 (1)ADAM33 rs678881： 哮喘組與對(duì)照組的ADAM33 rs678881 GC、CC及GG基因型比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.189，P<0.001)；與攜帶ADAM33 rs678881 GG基因型相比，攜帶GC、CC基因型的兒童更易發(fā)生支氣管哮喘(均P<0.05)。哮喘組ADAM33 rs678881 C等位基因分布頻率高于對(duì)照組(χ2=30.329，P<0.001)；與攜帶ADAM33 rs678881G等位基因相比，攜帶C等位基因型的兒童更易發(fā)生支氣管哮喘(P<0.05)。(2)ADAM33 rs2853209 ：兩組ADAM33 rs2853209各基因型比例以及等位基因分布頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.108，P=0.948；χ2=0.153，P=0.696)。見表1。

表1 ADAM33基因rs678881、rs2853209位點(diǎn)各基因型、等位基因分布及其與支氣管哮喘易感性的關(guān)系[n(%)]

2.2 兩組研究對(duì)象血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較 與對(duì)照組相比，哮喘組患兒血漿IL-4、IgE水平較高，而γ-干擾素水平較低(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組研究對(duì)象血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較(x±s)

2.3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型哮喘組患兒的血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較 ADAM33 rs678881各基因型患兒之間血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.011，P<0.001;F=9.637,P=0.001;F=103.882，P<0.001)，其中攜帶ADAM33 rs678881 GG、GC、CC基因型患兒血漿IL-4、IgE水平依次升高，而γ-干擾素依次降低(均P<0.05)。rs2853209各基因型患兒之間血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.535，P=0.591;F=0.393,P=0.677；F=2.064,P=0.130)。見表3。

表3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型支氣管哮喘患兒的血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較(x±s)

2.3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型與支氣管哮喘并發(fā)癥發(fā)生情況的比較 與攜帶ADAM33 rs678881 GG基因型相比，攜帶GC、CC基因型支氣管哮喘患兒的并發(fā)消化道反應(yīng)發(fā)生率較高(均P<0.05)，而縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭、心律失常、腎炎的發(fā)生率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表4。rs2853209各基因型支氣管哮喘患兒的消化道反應(yīng)、縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭、心律失常、腎炎發(fā)生率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表5。

表4 ADAM33 rs678881各基因型支氣管哮喘患兒的并發(fā)癥發(fā)生情況的比較[n(%)]

表5 ADAM33 rs2853209各基因型支氣管哮喘患兒的并發(fā)癥發(fā)生情況的比較[n(%)]

3 討 論

支氣管哮喘是兒童常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病。近年來我國(guó)兒童支氣管哮喘的患病率有逐漸增高的趨勢(shì)，其不僅影響患兒健康，還給家庭及社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[8]。多數(shù)支氣管哮喘患者經(jīng)規(guī)范、足療程的支氣管擴(kuò)張劑和吸入激素治療后病情可達(dá)到完全控制，但仍有部分患者的病情不能完全控制，特別是支氣管哮喘患兒，治療難度大，病情遷延易導(dǎo)致哮喘反復(fù)發(fā)作。因此，深入研究支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制，尋找關(guān)鍵的診斷治療靶點(diǎn)具有重要意義。支氣管哮喘是一種與多基因遺傳有關(guān)的疾病，受到遺傳和環(huán)境等因素的影響，目前已發(fā)現(xiàn)多種支氣管哮喘的易感基因，影響疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。ADAM33基因是近年來發(fā)現(xiàn)的新的支氣管哮喘易感基因，其為ADAM家族成員，編碼蛋白含800個(gè)氨基酸，包含許多保守的結(jié)構(gòu)域等，如信號(hào)肽、金屬蛋白酶、解整合素、跨膜結(jié)構(gòu)域及細(xì)胞內(nèi)糖蛋白結(jié)構(gòu)域，通過相應(yīng)結(jié)構(gòu)域參與各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明，ADAM33蛋白在平滑肌細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)豐富，而上皮細(xì)胞中表達(dá)量較低，ADAM33蛋白水解酶活性的提高與支氣管哮喘發(fā)生時(shí)氣道高反應(yīng)性及肺功能下降關(guān)系密切，參與氣道重塑等病理過程[10]。而ADAM33基因的SNP能影響支氣管哮喘的遺傳易感性[11]。因此，深入研究影響支氣管哮喘發(fā)生和發(fā)展的ADAM33基因關(guān)鍵SNP位點(diǎn)，為防治支氣管哮喘提供理論依據(jù)具有重要意義[12]。

本研究分析ADAM33 基因rs678881位點(diǎn)的SNP與支氣管哮喘易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，哮喘組ADAM33 rs678881 GC、CC基因型比例以及C等位基因頻率均更高(均P<0.05)；與攜帶ADAM33 rs678881 GG基因型、G等位基因相比，攜帶GC、CC基因型及C等位基因的兒童更易發(fā)生支氣管哮喘(P<0.05)。這表明ADAM33 rs678881 GC、CC基因型與支氣管哮喘的遺傳易感性有關(guān)，C等位基因型增加兒童支氣管哮喘的易感性[12]。分析原因可能是由于ADAM33 rs678881的基因位點(diǎn)位于基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的位置，正常上皮細(xì)胞中CpG島處于高甲基化狀態(tài)，而間質(zhì)細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞中甲基化程度較低，支氣管哮喘發(fā)生時(shí)該位點(diǎn)的SNP導(dǎo)致ADAM33基因甲基化程度減弱，促進(jìn)該基因的表達(dá)，ADAM33進(jìn)而參與促進(jìn)氣道高反應(yīng)性及氣道重塑性改變[5，13]。而本研究結(jié)果提示ADAM33 基因rs2853209位點(diǎn)的SNP未增加支氣管哮喘患兒的遺傳易感性，其機(jī)制尚不清楚，可能是該位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域，對(duì)ADAM33蛋白表達(dá)量及活性的影響不明顯。

此外，本研究中攜帶ADAM33 rs678881 GC、CC基因型的支氣管哮喘患兒血漿IL-4、IgE水平均明顯高于攜帶GG基因型的患兒，而γ-干擾素水平均低于GG基因型患兒(均P<0.05)，表明ADAM33 基因rs678881的SNP可能與反映支氣管哮喘嚴(yán)重程度的血漿指標(biāo)γ-干擾素、IL-4、IgE水平有關(guān)，ADAM33基因rs678881的SNP也參與促進(jìn)支氣管哮喘的發(fā)展。其原因可能為：一方面，ADAM33 基因的表達(dá)受到氣道炎癥程度的調(diào)控。研究顯示，支氣管哮喘發(fā)生時(shí)，Th2類細(xì)胞因子如IL-4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β能夠直接促進(jìn)ADAM33 基因的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分化及增殖，導(dǎo)致氣道重塑[14]，而抑制ADAM33 基因表達(dá)的γ-干擾素顯著下調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[15]。另一方面，ADAM33本身具有金屬蛋白酶活性，能夠促進(jìn)膜結(jié)合的生長(zhǎng)因子及其相應(yīng)受體的釋放，如表皮生長(zhǎng)因子及其受體、胰島素生長(zhǎng)因子及其受體等，促進(jìn)T細(xì)胞向Th1和Th2亞型分化，促進(jìn)Th2亞型IL-4的表達(dá)，招募并活化B細(xì)胞產(chǎn)生IgE[16-17]。因此，ADAM33與γ-干擾素、IL-4等炎癥介質(zhì)間可能存在正反饋環(huán)路，共同促進(jìn)支氣管哮喘的發(fā)展。

本研究進(jìn)一步分析ADAM33基因rs678881及rs2853209位點(diǎn)各基因型與支氣管哮喘患兒并發(fā)癥的關(guān)系，結(jié)果顯示攜帶ADAM33基因rs678881 GC、CC基因型支氣管哮喘患兒的消化道反應(yīng)的發(fā)生率高于GG基因型(P<0.05)，而不同rs2853209基因型患兒間的并發(fā)癥的發(fā)生率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明ADAM33 rs678881 GC、CC基因型可能有助于判斷支氣管哮喘患兒有無消化道反應(yīng)的發(fā)生，其原因可能是rs678881 GC、CC基因型患兒的機(jī)體處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)較重，引起胃腸道功能紊亂，導(dǎo)致嘔吐、腹瀉等臨床癥狀[18]。

綜上所述，ADAM33 rs678881 GC、CC基因型及C等位基因增加支氣管哮喘患兒的易感性，而rs2853209基因SNP可能與支氣管哮喘患兒的易感性無關(guān)。同時(shí)，攜帶ADAM33 rs678881 GC、CC基因型的支氣管哮喘患兒血漿IL-4、IgE水平較高而γ-干擾素水平較低，且消化道反應(yīng)的發(fā)生率高，ADAM33 rs678881 GC、CC基因型可能參與了兒童支氣管哮喘的發(fā)展。但本研究樣本量較小，未能考慮環(huán)境因素對(duì)支氣管哮喘的影響，因此有待進(jìn)一步研究以驗(yàn)證ADAM33基因SNP對(duì)兒童支氣管哮喘發(fā)生與發(fā)展機(jī)制的影響。